瀏陽豆豉晾曲階段相關指標的變化研究

覃業(yè)優(yōu)，周 曉，胡嘉亮，顏 婷，劉 洋

（1.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128）

豆豉是我國四大傳統(tǒng)發(fā)酵大豆制品之一[1]，因其富含營養(yǎng)、口感獨特，一直深受人們喜愛[2]，是人們餐桌上不可缺少的食品和調(diào)味品，其種類根據(jù)形態(tài)、產(chǎn)地和發(fā)酵微生物的不同分有多個品種[3-6]。瀏陽豆豉是湖南特色的發(fā)酵豆制品，也是國家地理標志性產(chǎn)品，是以泥豆或小黑豆為原料，經(jīng)過浸泡、蒸煮、自然制曲、洗曲、堆積發(fā)酵、曬干而成的曲霉型淡豆豉[7]，歷史悠久，藥食兼用[8]。一般由黑豆經(jīng)過發(fā)酵制成豆豉只要半個月左右的時間，成品豆豉呈黑褐色或醬紅色，風味濃郁。但生產(chǎn)更多的沿襲傳統(tǒng)工藝，以經(jīng)驗式控制為主，存在生產(chǎn)條件粗放、裝備比較落后等問題，且至今仍然沒有明確的質(zhì)量標準和生產(chǎn)規(guī)范，存在一定的安全隱患。盡管由于其低鹽被作為藥食同源使用，但由于產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，日常仍主要作為調(diào)味品使用，如瀏陽蒸菜。

在實際生產(chǎn)過程中，瀏陽豆豉的前期發(fā)酵采用自然制曲的方法，將熟化冷卻后的黑豆原料放入曲室內(nèi)進行自然發(fā)酵，使得微生物在適宜的溫度和濕度條件下生長并分泌多種胞外酶。發(fā)酵至7 d左右，豆粒表面覆蓋1～2 cm厚的菌絲，菌絲顏色由白變灰并出現(xiàn)黑色孢子[9]，制曲進入成熟階段，此時微生物生長旺盛酶系多且活力高，但豆醅溫度較高，容易出現(xiàn)燒曲現(xiàn)象[5]，應開窗通氣降溫，控制微生物生長，俗稱“晾曲”，即晾曲階段。經(jīng)3～8 d甚至更長時間的“晾曲”（晾曲時間根據(jù)天氣情況確定），豆醅水分含量降低，所得黑豆干而不燥，表面無水滴，手抓不粘，無異臭后，再進行洗曲。洗曲的目的是去除豆曲表面的曲霉菌孢子、菌絲及黏附物[9]，使蛋白酶活力降低避免苦味肽的過多產(chǎn)生[10]，洗曲后曲料含水量達到45%，利于后續(xù)發(fā)酵。目前，國內(nèi)關于瀏陽豆豉的研究主要集中在微生物菌種篩選、鑒定及分布和微生物多樣性[11-13]，也有對瀏陽豆豉生產(chǎn)工藝比較、生物活性、酶活性及揮發(fā)性物質(zhì)的研究[14-16]，關于曲霉型豆豉制曲和發(fā)酵過程中的微生物群落的研究也有很多學者關注[17-18]。但目前關于晾曲對豆豉生產(chǎn)的影響鮮見報道。

本研究對瀏陽豆豉晾曲階段微生物、理化指標及關鍵酶活性的變化規(guī)律進行研究，探索該工序對瀏陽豆豉品質(zhì)的影響以及其存在的必要性，可為瀏陽豆豉品質(zhì)的穩(wěn)定和提高提供數(shù)據(jù)支撐，為瀏陽豆豉的工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑豆（陜西腎型小黑豆）：市售。

1.1.2 試劑

氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、95%乙醇、酚酞、甲醛、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸（均為分析純或生化試劑）：上海國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇、二甲基亞砜（均為色譜純）：上海杰星生物科技有限公司；大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素標準品（純度≥98%）：成都曼思特生物科技有限公司；α-淀粉酶試劑盒、纖維素酶試劑盒、脂肪酶試劑盒、中性蛋白酶試劑盒、酸性蛋白酶試劑盒、堿性蛋白酶試劑盒：武漢默沙克生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

W-HL218超低溫冷凍儲存箱：合肥美的電冰箱有限公司；LDZX-50 KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250智能生化培養(yǎng)箱：上海飛越實驗儀器有限公司；JE502電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；DSHZ-82B水浴恒溫振蕩器：常州金南儀器制造有限公司；SW-CJ-1F CIMO新苗無菌超凈工作臺：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Read Max 1900光吸收全波長酶標儀：上海閃譜生物科技有限公司；PHS-3C雷磁pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Agilent1100series高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）儀：安捷倫科技（中國）有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豆豉曲的制備及取樣

參照陳怡等[11]的方法制備瀏陽豆豉曲。將豆豉曲從培養(yǎng)箱中取出，放置在通風干燥處，開始晾曲，取晾曲0、6 h、18 h、24 h、30 h、42 h、48 h、72 h、96 h共9個豆豉曲樣品。所有豆豉曲樣品經(jīng)標記后均放入-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 微生物數(shù)量的測定

菌落總數(shù)測定：參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[19]；霉菌和酵母總數(shù)測定：參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)》[20]。

1.3.3 理化指標的測定

水分含量的測定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[21]；總糖含量的測定：參照索化夷等[22]的3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法；總酸含量的測定：參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》[23]中的酸堿滴定法；氨基酸態(tài)氮含量的測定：參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[24]中的酸度計法；大豆異黃酮的測定：參照GB/T 23788—2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法高效液相色譜法》[25]。

1.3.4 關鍵酶活性的測定

按照試劑盒說明書測定豆豉曲的α-淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶和蛋白酶活力。α-淀粉酶活力定義：每g磨碎樣品組織每分鐘催化產(chǎn)生1 mg還原糖定義為1個酶活力單位（U/g）。纖維素酶活力定義：每g磨碎樣品每分鐘催化產(chǎn)生1 μg 葡萄糖定義為1個酶活力單位（U/g）。脂肪酶活力定義：37 ℃中每g磨碎樣品每分鐘水解橄油生成1 μmo1脂肪酸為1個酶活力單位（U/g）。蛋白酶活力定義：37 ℃中每g磨碎樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個酶活力單位（U/g）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

所有試驗重復測定三次，結果用“平均值±標準偏差”來表示，使用Excel 2016進行數(shù)據(jù)分析和圖表制作，用IBM SPSS Statistics 26.0軟件進行方差分析和Pearson's相關性分析。

2 結果與分析

2.1 瀏陽豆豉晾曲階段水分含量的變化

在晾曲階段，豆豉曲發(fā)生最明顯的變化是水分含量下降，水分含量是判斷豆醅是否可以洗曲的重要依據(jù)。當豆豉曲干而不燥、不粘膩時方可進行洗曲，因此，測定晾曲階段豆豉曲的水分含量很有必要，且水分含量對豉曲的微生物數(shù)量、基本品質(zhì)指標和酶活均有直接或間接的影響。晾曲階段豆豉曲水分含量的變化見圖1。

圖1 瀏陽豆豉晾曲階段水分含量的變化Fig.1 Changes of moisture of Liuyang Douchi during koji-cooling stage

由圖1可知，在晾曲階段，豉曲水分含量呈明顯的下降趨勢，晾曲開始時，水分含量為41.67%，晾曲結束后水分含量減少了42.88%，僅為23.80%，與謝靚等[26]洗曲前的水分相比，本實驗中豆豉曲的水分含量偏低，可能是晾曲階段受外界環(huán)境濕度低等影響較大有關。

2.2 瀏陽豆豉晾曲階段微生物數(shù)量的變化

瀏陽豆豉作為典型的傳統(tǒng)曲霉型發(fā)酵豆豉，其風味和微生物作用密切相關[27]。盡管接入純種米曲霉，但固態(tài)發(fā)酵模式下仍有大量的微生物參與制曲過程。有研究表明，豆豉發(fā)酵整體以霉菌、細菌和酵母菌為主，但均是以制曲階段和堆積發(fā)酵階段的豆豉曲為樣品[28]。因此，測定晾曲階段豉曲的細菌和真菌（霉菌和酵母）總數(shù)的變化，結果見圖2。

圖2 瀏陽豆豉晾曲階段菌落總數(shù)和真菌總數(shù)的變化Fig.2 Changes of total colonies counts and fungi counts of Liuyang Douchi during koji-cooling stage

由圖2可知，在晾曲階段，豆豉曲的菌落總數(shù)明顯高于霉菌和酵母總數(shù)，這與汪孟娟等[29]研究結果一致。結合水分含量的變化，在晾曲6～30 h水分含量明顯下降的同時，細菌、霉菌和酵母總數(shù)均有明顯增長。晾曲30 h后，水分含量持續(xù)下降，微生物數(shù)量卻基本穩(wěn)定，可能由于低水分環(huán)境抑制了微生物增殖。當晾曲時間為96 h時，微生物數(shù)量最高，這與謝靚等[26]發(fā)現(xiàn)細菌和真菌數(shù)量在洗曲時均累積達到最大值的結果基本一致。

2.3 瀏陽豆豉晾曲階段總糖、總酸和氨基酸態(tài)氮含量的變化

晾曲階段豆豉曲總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮含量的變化可以反映此工序對瀏陽豆豉生產(chǎn)工藝的重要性[30]，因此，測定不同晾曲時間豆豉曲總糖、總酸和氨基酸態(tài)氮含量的變化，結果見圖3。

圖3 瀏陽豆豉晾曲階段總糖（a）、總酸（b）及氨基酸態(tài)氮（c）含量的變化Fig.3 Changes of total sugar (a), total acid (b) and amino acid nitrogen (c) contents of Liuyang Douchi during koji-cooling stage

由圖3a可知，在晾曲階段，總糖含量持續(xù)下降，與索化夷等[22]的研究報道相似，總糖含量從8.20%降到5.09%，推測原因可能是隨著發(fā)酵的進行，微生物呼吸作用加劇，部分糖被分解。由圖3b可知，豆豉曲的總酸含量整體呈增長趨勢，與謝靚等[26]檢測結果類似，晾曲開始時總酸含量達0.75%，晾曲96 h后總酸含量增加到1.46%；觀察晾曲時間在18～30 h的總酸含量發(fā)現(xiàn)，此時間段總酸含量增幅很小，而在此期間水分含量出現(xiàn)明顯下降、微生物數(shù)量明顯增加的現(xiàn)象，說明在這個時間段內(nèi)微生物及酶降解糖類產(chǎn)生的有機酸大部分隨水分減少而損失。由圖3c可知，豆豉曲的氨基酸態(tài)氮含量累積升高，在晾曲96 h達到最高（0.88%），整個晾曲過程氨基酸態(tài)氮含量增加了0.16%，漲幅較小，但高于文獻[26]中氨基酸態(tài)氮含量漲幅（0.04%），說明可能在晾曲階段微生物和有關酶對蛋白質(zhì)的降解等代謝活動不活躍。

2.4 瀏陽豆豉晾曲階段大豆異黃酮組成及含量的變化

大豆異黃酮，又被稱為植物雌激素，目前已知的大豆異黃酮共有12種，主要包括難以被人體腸道吸收的糖苷型異黃酮（大豆苷、染料木苷）和易被吸收的苷元型異黃酮（大豆苷元、染料木素）[31]。大豆異黃酮具有抗腫瘤、抗膽固醇、抗氧化等多種生物活性，其中染料木素對抑制癌細胞的增殖有一定的抑制作用[32]。豆豉原料中的大豆異黃酮絕大部分是糖苷型異黃酮，經(jīng)微生物發(fā)酵和β-葡萄糖苷酶的降解，苷元型異黃酮含量上升，不僅有利于人體吸收，也能提高豆豉的抗氧化活性，瀏陽豆豉晾曲階段大豆異黃酮含量的變化見表1。

表1 瀏陽豆豉晾曲階段大豆異黃酮組成及含量的變化Table 1 Changes of composition and contents of soybean isoflavones in Liuyang Douchi during koji-cooling stage

由表1可知，瀏陽豆豉晾曲階段，大豆苷和染料木苷的含量均呈下降趨勢，大豆苷元和染料木素的含量則呈上升趨勢，說明在晾曲階段糖苷型大豆異黃酮向苷元型大豆異黃酮的轉化明顯[7]。其中，大豆苷和染料木苷的含量分別減少了60.58%和67.53%，而對應的大豆苷元和染料木素的含量分別增加95.10%和83.32%，說明在晾曲階段大豆苷有很大一部分轉化成了大豆苷元，其利用率較高，染料木苷相對來說損失的較高；苷元型大豆異黃酮在總大豆異黃酮中的占比從晾曲開始的25.98%增長到晾曲結束時的65.78%，這可能與豆豉曲中β-葡萄糖苷酶的活性較高有關。且與某些豆豉曲對比，黑豆原料中大豆異黃酮含量普遍偏高[22]。霍紅等[33]也發(fā)現(xiàn)黑色大豆以及黑豆豆豉中的染料木素含量均高于黃色大豆和黃豆豆豉，陳怡等[31]研究也得出以黃豆為原料的細菌型豆豉中的苷元型大豆異黃酮含量均低于以黑豆為原料的曲霉型豆豉。

2.5 瀏陽豆豉晾曲階段關鍵酶活性的變化

微生物分泌各種酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶對原料發(fā)酵有很大作用[34]。因此，對晾曲階段豆豉曲的關鍵酶活力進行測定，結果見圖4。由圖4可知，α-淀粉酶的活力整體呈先上升后下降的趨勢，在晾曲42 h時達到最高值（1.98 U/g）。纖維素酶活力整體較高，但也呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，晾曲30 h時最高為475 U/g，晾曲96 h時降到最低（271 U/g）。α-淀粉酶和纖維素酶后期酶活的降低可能是導致總酸含量在晾曲后期增長緩慢的原因。脂肪酶活力在晾曲階段出現(xiàn)兩次明顯增長和降低，但酶活整體呈下降的趨勢，最低酶活力出現(xiàn)在晾曲42 h僅為35 U/g，分析原因可能是取樣差異以及環(huán)境影響。米曲霉所產(chǎn)的蛋白酶在較廣的pH范圍內(nèi)皆有活性[35]，在豆豉曲晾曲階段，蛋白酶酶活中中性蛋白酶優(yōu)勢明顯，其次是堿性蛋白酶，這與趙文鵬[36]研究發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶在發(fā)酵過程中起主要作用的結論一致。但與邵良偉等[37]研究的潼川毛霉型豆豉制曲過程中的蛋白酶活力相比，優(yōu)勢蛋白酶差異較大，后者的優(yōu)勢蛋白酶為酸性蛋白酶，其次是中性蛋白酶，可以反映出不同霉菌型發(fā)酵豆豉的區(qū)別。

圖4 瀏陽豆豉晾曲階段α-淀粉酶（a）、纖維素酶（b）、脂肪酶（c）和蛋白酶（d）活力的變化Fig.4 Changes of activities of α-amylase(a), cellulase (b), lipase (c) and protease (d) of Liuyang Douchi during koji-cooling stage

2.6 瀏陽豆豉晾曲階理化指標與微生物數(shù)量、關鍵酶活力間的相關性分析

總酸和氨基酸態(tài)氮是評判豆豉質(zhì)量高低的重要指標，晾曲階段微生物數(shù)量和酶活對洗曲后渥堆發(fā)酵具有重要的影響，因此，對瀏陽豆豉晾曲階理化指標與微生物數(shù)量、關鍵酶活力間的相關性進行分析，可對工業(yè)化生產(chǎn)定向調(diào)控提供理論支撐，結果見表2。

表2 瀏陽豆豉晾曲階理化指標與微生物數(shù)量、關鍵酶活力間的相關性分析結果Table 2 Results of correlation analysis between physicochemical indexes, microbial quantities and key enzyme activities of Liuyang Douchi during koji-cooling stage

由表2可知，豆豉曲的水分含量變化與菌落總數(shù)呈顯著正相關（P＜0.05），而與霉菌和酵母總數(shù)的相關性極低，說明真菌的生長繁殖受水分影響小。水分含量對關鍵酶活的影響也很小，因此酶活力的差異可能與菌種的差異有關。總糖含量變化與水分含量變化、菌落總數(shù)、α-淀粉酶以及纖維素酶活力均呈顯著正相關（P＜0.05），說明在晾曲階段除一部分總糖隨水分流失以外，還出現(xiàn)了部分總糖轉化為還原糖以及微生物和酶對單糖的消耗，以上可能是導致總糖含量下降的重要原因。氨基酸態(tài)氮含量變化與水分含量變化呈顯著負相關（P＜0.05），而與中性蛋白酶呈顯著正相關（P＜0.05），說明水分的減少對氨基酸態(tài)氮主要起到了濃縮的作用，其與中性蛋白酶的相關性反映出氨基酸態(tài)氮的來源與酶有密切聯(lián)系，該分析結果在近年的研究報道中也有類似的發(fā)現(xiàn)[36]。同時從表2中也可知，霉菌和酵母總數(shù)與水分、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮含量變化均沒有顯著相關性（P＞0.05），總酸含量與其他各項指標也沒有顯著相關性（P＞0.05），總酸含量增加可能與酶的水解有關。

3 結論

本研究考察了瀏陽豆豉晾曲階段理化指標、微生物、酶系變化，并通過相關性分析分析其對豆豉品質(zhì)的影響，結果發(fā)現(xiàn)，在晾曲階段，晾曲過程中，豆豉曲的菌落總數(shù)、霉菌和酵母總數(shù)均呈逐漸上升的趨勢，并在96 h達到最大值，分別為5.9×109CFU/g和7.6×106CFU/g；水分含量減少至23.80%，總糖含量下降至5.09%，而總酸、氨基酸態(tài)氮和苷元型異黃酮含量分別上升至1.46%、0.88%、1 383.90 mg/kg；除中性蛋白酶外，α-淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶的活力整體均先升高后降低，且在晾曲階段中性蛋白酶為主要酶。相關性分析結果表明，瀏陽豆豉晾曲階段，水分含量與菌落總數(shù)，總糖含量與菌落總數(shù)、α-淀粉酶、纖維素酶活力，以及氨基酸態(tài)氮含量與中性蛋白酶活力呈顯著正相關（P＜0.05），而氨基酸態(tài)氮含量與水分含量呈顯著負相關（P＜0.05）。結果表明，晾曲對整個制曲階段具有一定的影響，該結果可為瀏陽傳統(tǒng)曲霉型豆豉的工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。