威士忌制備過(guò)程中理化指標(biāo)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律研究

陳文波，張 一，李小燕，楊海鶯，牛麗敏，3，趙 凱，李 慧*

（1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司 老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室 營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；3.河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；4.中糧糧谷控股有限公司，北京 100020）

威士忌（Whisky）是以水、發(fā)芽或未發(fā)芽谷物、酵母為原料，通過(guò)糖化、液態(tài)發(fā)酵、蒸餾，再經(jīng)橡木桶熟陳、最后裝瓶制成的一種酒精度不低于40%vol（ABV）的飲料[1-3]。根據(jù)歐洲關(guān)于威士忌的定義，威士忌是由發(fā)芽谷物或發(fā)芽谷物的糖化酶轉(zhuǎn)化的其他谷物制成的糖化液經(jīng)發(fā)酵、蒸餾制成的一種酒精飲料[4]。為保留原料自身的風(fēng)味，蒸餾時(shí)酒精度不能超過(guò)94.8%vol[5]。在威士忌制備過(guò)程中發(fā)酵和蒸餾是兩個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，發(fā)酵是酒精的生產(chǎn)，而蒸餾則是酒精的分離[6-8]。

發(fā)酵是威士忌生產(chǎn)中最重要的步驟，是指將酵母接種到麥汁中，讓其利用麥汁中的糖分轉(zhuǎn)化成酒精的過(guò)程[7，9]。典型麥汁中通常含有2%蔗糖、1%果糖、10%葡萄糖、50%麥芽糖、15%麥芽三糖、10%麥芽四糖和10%糊精，在酵母的作用下蔗糖、果糖、葡萄糖和麥芽糖會(huì)被很快消耗，麥汁也轉(zhuǎn)化為原酒漿麥汁，并在酵母的作用下轉(zhuǎn)化為原酒漿[10-11]。另外，酵母在不同生長(zhǎng)溫度下會(huì)產(chǎn)生多種有機(jī)酸（如乙酸、琥珀酸等）、高級(jí)醇、羧酸、酯、醛、酮等[10-14]，而且這些物質(zhì)通常會(huì)保留到威士忌新酒中，對(duì)威士忌的最終風(fēng)味形成也有重要貢獻(xiàn)[11-12]。宋緒磊等[15]考察了不同酵母對(duì)威士忌品質(zhì)的影響，結(jié)果表明不同酵母對(duì)原酒漿（起始麥汁濃度為14.9°P）的pH、總酸、發(fā)酵度影響較大，發(fā)酵結(jié)束時(shí)原酒漿的酒精度為5.24%vol～6.42%vol，殘?zhí)菫?.0～4.1 g/100 g。蒸餾是實(shí)現(xiàn)威士忌酒精度提升的重要手段[8-10，16]。在蒸餾過(guò)程中，加熱原酒漿直至沸騰狀態(tài)，不同沸點(diǎn)的物質(zhì)隨著溫度的升高將依次蒸發(fā)出來(lái)，收集后獲得不同的餾分[17]。酒精是不同餾分的主要成分，通常在78.15 ℃時(shí)以酒精-水共沸物的形式被蒸出[18]。當(dāng)溫度低于78.15 ℃時(shí)，餾分中還會(huì)混合有許多低沸點(diǎn)的物質(zhì)，如乙醛；當(dāng)溫度高于78.15 ℃時(shí)，高沸點(diǎn)的物質(zhì)隨即進(jìn)入餾分中，如長(zhǎng)鏈脂肪酸乙酯[18]。此外，蒸餾還促進(jìn)發(fā)酵液中前體物質(zhì)的相互作用，生成新風(fēng)味物質(zhì)[19]。因此，研究發(fā)酵過(guò)程中糖類、酸類等理化指標(biāo)變化及蒸餾過(guò)程風(fēng)味物質(zhì)變化，對(duì)優(yōu)化威士忌生產(chǎn)工藝，酒心和酒尾的摘取提供科學(xué)依據(jù)，提升威士忌的品質(zhì)有重要意義。

本研究以蒸餾麥芽為原料、以威士忌專用商業(yè)酵母為發(fā)酵劑開(kāi)展麥汁發(fā)酵和原酒漿的蒸餾。采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等技術(shù)分析原酒漿發(fā)酵及蒸餾過(guò)程中理化指標(biāo)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和層次聚類分析（hierarchial clustering analysis，HCA），以期明確發(fā)酵與蒸餾理化指標(biāo)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律，為中國(guó)威士忌的高質(zhì)量發(fā)展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蒸餾麥芽：中糧麥芽（大連）有限公司；威士忌專用活性干酵母粉：法國(guó)Fermentis公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、麥芽三糖（均為色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；1,2,3-三氯丙烷（色譜純）：北京曼哈格生物科技有限公司；正構(gòu)烷烴（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙酸、丙酸、乳酸（均為色譜純）、無(wú)水乙醇、氯化鈉、濃硫酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Grainfather G70 Brewing Systerm、Grainfather Conical Fermenter、Grainfather Glycol Chiller：新西蘭Bevie Handcraft公司；50 L純銅塔式蒸餾器：山東海潤(rùn)智造高端裝備科技有限公司；ME 203天平：美國(guó)梅特勒公司；PB-10酸度計(jì)：德國(guó)賽多利斯公司；DMA 4500M密度儀：奧地利Anton Paar公司；LA-20AT高效液相色譜儀、Nexis GC-2030氣相色譜儀（配HSS-30A頂空進(jìn)樣器、氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）、電子捕獲檢測(cè)器（electron capture detector，ECD））、GCMS-2020NX氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（配AOC-6000多功能自動(dòng)進(jìn)樣器）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 威士忌釀造工藝流程及操作要點(diǎn)[20-23]

麥芽粉碎→糖化→發(fā)酵→蒸餾→桶陳

操作要點(diǎn)：

麥芽糖化：將10 kg麥芽粉碎（對(duì)輥間距為1.5 mm），加入35 L的熱水中（水溫為68 ℃），在糖化過(guò)程中于65 ℃保溫1.5 h，使用80 ℃的熱水進(jìn)行洗糟，至麥芽糖度為16°P。使用盤(pán)管冷凝器將麥汁冷卻30 ℃以下，并泵入Grainfather Conical Fermenter。

發(fā)酵：將活性干酵母置于10倍其質(zhì)量的無(wú)菌水或麥汁（25～35 ℃）中，靜置15 min，輕輕搖動(dòng)，使其形成酵母漿后使用[20]?；罨湍赴?0 g/L的用量，接入冷卻后的麥汁中，連接冷水機(jī)后，在（32.0±0.5）℃進(jìn)行發(fā)酵，每24 h取樣分析麥汁理化性質(zhì)和風(fēng)味的變化情況。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵罐單向水封閥不再有氣泡冒出，發(fā)酵液中酵母出現(xiàn)沉淀，同時(shí)發(fā)酵液的比重不再發(fā)生變化[24]。

蒸餾：將原酒漿倒入安裝好的蒸餾設(shè)備中，設(shè)定目標(biāo)溫度100 ℃進(jìn)行蒸餾。前150 mL作為一個(gè)餾分，之后每10 min收集一個(gè)餾分。當(dāng)餾分酒精度首次低于40%vol時(shí)，每5 min收集一個(gè)餾分，直至餾分中酒精度低于20%vol[25]。對(duì)所得餾分依次編號(hào)，用于餾分組成及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析。

1.3.2 理化指標(biāo)檢測(cè)

麥汁、威士忌原酒漿及餾分的糖、酸含量和酒精度使用高效液相色譜法測(cè)定，并使用外標(biāo)定量法進(jìn)行定性及定量。

樣品前處理：麥汁經(jīng)0.45 μm孔徑的無(wú)機(jī)相濾膜、原酒漿上清和各餾分樣品經(jīng)0.45 μm孔徑的有機(jī)相濾膜過(guò)濾后得待測(cè)液。

HPLC條件[26-27]：Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm）；柱溫65 ℃；流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4，流速為0.600 mL/min。檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，進(jìn)樣量20 μL。

定性及定量方法：配制已知質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（葡萄糖、麥芽糖、果糖、乙酸、丙酸、乳酸）和已知體積分?jǐn)?shù)的酒精標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)與上述相同處理后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢索樣品與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致的峰進(jìn)行定性，使用外標(biāo)定量法對(duì)樣品中目標(biāo)峰進(jìn)行定量。

1.3.3 麥汁及餾分中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的檢測(cè)

麥汁及餾分中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定采用GC-MS檢測(cè)。

樣品制備：取5 mL發(fā)酵液或餾分樣品至20 mL頂空進(jìn)樣瓶，準(zhǔn)確加入2,3-三氯丙烷（10 mg/L）內(nèi)標(biāo)溶液150 μL，加密封墊、鋁蓋壓緊搖勻。將準(zhǔn)備好的頂空測(cè)試樣品，放置于頂空固相微萃取自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，60 ℃恒溫振蕩10 min，待頂空風(fēng)味物質(zhì)濃度達(dá)到平衡后插入SPME fiber，萃取30 min后拔出，插入進(jìn)樣口，脫附3 min[28]。

氣相色譜條件[29]：DB-WAX57CB色譜柱（50m×0.25mm，0.2 μm）；載氣為高純度氦氣（He）（99.999%），流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；解吸時(shí)間1min；升溫程序：初始溫度40℃，保持3 min，以10 ℃/min速度上升到150 ℃，隨后以4 ℃/min速度上升到230 ℃，保持8 min。進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間2 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；掃描方式：質(zhì)譜掃描范圍：30～500 m/z。

定性定量分析方法：通過(guò)GC-MS檢測(cè)分析啤酒揮發(fā)性化合物總離子流色譜圖，自動(dòng)識(shí)別信噪比（S/N）＞200的色譜峰，通過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）14譜庫(kù)與樣品色譜峰進(jìn)行比對(duì)分析，篩選得到匹配度＞80%的物質(zhì)，并結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）計(jì)算值與文獻(xiàn)RI值差值（＜50）進(jìn)行定性分析。采用半定量法計(jì)算揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量。

1.3.4 氣味活度值篩選關(guān)鍵風(fēng)味化合物

采用氣味活度值（ordor activity value，OAV）評(píng)價(jià)各化合物對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)，將OAV＞1是樣品中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，其值越大代表其貢獻(xiàn)性越大[30]。OAV計(jì)算公式如下：

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用MS Office 2016。不同樣本的單因素方差分析使用SPSS 25.0；層次聚類分析、主成分分析使用JMP 17.0[31-32]，使用Origin 2019繪圖。研究中理化指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 威士忌發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化

對(duì)威士忌發(fā)酵過(guò)程中麥汁及原酒漿的酒精度、3種糖組分（葡萄糖、麥芽糖、果糖）和3種酸組分（乙酸、丙酸、乳酸）進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 威士忌發(fā)酵過(guò)程中麥汁及原酒漿理化指標(biāo)的變化Fig.1 Changes of physicochemical indexes in wort and original liquor pulp during whisky fermentation process

由圖1A可知，由于酵母菌無(wú)氧發(fā)酵利用麥汁中的糖分生成酒精，因此發(fā)酵前2 d酒精度在原酒漿中呈上升趨勢(shì)，并在第2天時(shí)達(dá)到最大值，為8.20%vol。在發(fā)酵第2～3天酒精度下降，這是因?yàn)樵茲{中的糖分消耗殆盡后，酵母開(kāi)始利用乙醇合成相應(yīng)的代謝產(chǎn)物[33-34]。酵母在代謝酒精的過(guò)程中，酒精不僅可用于乙酰輔酶A的合成，進(jìn)而用于三羧酸循環(huán)，還會(huì)在其代謝到乙醛的過(guò)程中產(chǎn)生還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），成為細(xì)胞內(nèi)重要的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）來(lái)源[34]。由圖1B可知，麥汁中含量最高的糖組分為麥芽糖，為72.195 g/L。隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，麥芽糖、葡萄糖和果糖都下降明顯，第1天降幅最大，麥芽糖、葡萄糖和果糖分別降至2.969 g/L、0.260 g/L和0.739 g/L，這表明活化后的酵母細(xì)胞代謝活力急劇上升，在接入麥汁中會(huì)快速將其中可利用的糖分耗盡。糖分的這種變化與Lager酵母在不同麥汁中代謝糖分的規(guī)律接近[35]。由圖1C可知，丙酸和乳酸含量在發(fā)酵過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，乙酸含量在發(fā)酵過(guò)程中呈穩(wěn)定趨勢(shì)，在發(fā)酵第3天時(shí)乙酸、丙酸和乳酸含量分別達(dá)到0.029 g/L、0.135 g/L和0.491 g/L。由于威士忌制備時(shí)所用的麥汁未經(jīng)煮沸殺菌，這些酸含量在第3天最高的原因可能是乳酸菌等微生物產(chǎn)酸所致。酸類物質(zhì)在調(diào)和威士忌口感的同時(shí)還可與醇類物質(zhì)酯化生成酯類化合物，為威士忌增加獨(dú)特的風(fēng)味[13]。結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程中適當(dāng)允許產(chǎn)酸微生物的存在對(duì)于提升威士忌的品質(zhì)是必要的。

2.2 威士忌發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

威士忌發(fā)酵過(guò)程中麥汁及原酒漿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAV變化見(jiàn)表1。由表1可知，從麥汁及原酒漿中共檢出具有OAV的揮發(fā)性風(fēng)味化合物44種，其中醇類8種，醛類4種，酮類3種，酯類27種，其他類2種。因閾值較高或無(wú)閾值，酸類物質(zhì)OAV未得到。

表1 威士忌發(fā)酵過(guò)程中麥汁及原酒漿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)氣味活度值變化Table 1 Changes of odor activity values of volatile flavor compounds in wort and original liquor pulp during whisky fermentation process

由表1可知，醇類物質(zhì)是威士忌的基本香氣成分之一，這些物質(zhì)主要來(lái)源于酵母發(fā)酵麥汁（谷物糖化液）過(guò)程中氨基酸代謝或糖代謝產(chǎn)物。麥汁和原酒漿中共檢出8種醇類化合物，其中僅異戊醇在原酒漿中OAV＞1，能為發(fā)酵麥汁帶來(lái)雜醇味、發(fā)酵味、果味、香蕉味和輕微白蘭地味。

酯類物質(zhì)是威士忌酒的重要香氣物質(zhì)，主要產(chǎn)生于酵母的麥汁（谷物糖化液）酒精發(fā)酵及橡木桶桶陳過(guò)程[7]，能賦予威士忌酒濃郁的花香和果香。麥汁和原酒漿中共檢出27種酯類化合物，其中麥汁中檢出2種OAV＞1的酯類化合物，分別為癸酸甲酯和棕櫚酸甲酯，賦予麥汁果味、脂肪味、蠟味等風(fēng)味特點(diǎn)。原酒漿中共檢出12種OAV＞1的酯類化合物，分別為癸酸甲酯、棕櫚酸甲酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸甲酯、棕櫚酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯，其中己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸甲酯OAV最高，能賦予威士忌蠟味、果味（香蕉味、菠蘿味）、甜味、葡萄酒味、奶油脂肪味、肥皂味、白蘭地味等風(fēng)味特點(diǎn)。在這些酯中，乙酸酯的數(shù)量近40%，這也說(shuō)明乙酸酯是發(fā)酵過(guò)程中具有快速生成的優(yōu)勢(shì)，是原酒漿中風(fēng)味物質(zhì)的重要組成部分[36]。

醛類和酮類也是威士忌的香氣組成成分。麥汁和原酒漿中共檢測(cè)4種醛類和3種酮類，僅壬醛OAV＞1，能賦予威士忌醛香味、柑橘味、黃瓜和瓜皮味、輕微生土豆和油膩堅(jiān)果和椰子味。麥汁和原酒漿檢出2種其他類化合物，其中僅2-甲氧基-4-乙烯苯酚在原酒漿中OAV＞1，能賦予威士忌辛辣粉味、丁香酚味、木質(zhì)味、煙熏味、松脂味。

2.3 餾分中酒精度及酸類物質(zhì)的變化

典型麥芽威士忌的發(fā)酵過(guò)程通常有乳酸菌等微生物的參與，因此威士忌酒廠在進(jìn)行威士忌的蒸餾時(shí)不僅關(guān)注酒精濃度的變化，也會(huì)聚焦餾分中酸類物質(zhì)的變化情況，以獲得高品質(zhì)威士忌新酒[11，13]。威士忌蒸餾過(guò)程中酒精度及酸類物質(zhì)變化結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2A可知，在蒸餾過(guò)程中酒精度呈下降趨勢(shì)，其中第1個(gè)餾分中酒精度最高，為71.0%vol。餾分2和3酒精度在55%vol左右，20～40 min酒精度在50%vol左右；餾分4～7酒精度降至43.1%vol，在第70 min時(shí)酒精度降至35.5%vol。餾分8～11酒精度已經(jīng)降至35%vol以下。餾分10的酒精度降至20.53%vol。這表明餾分中高于酒精沸點(diǎn)的物質(zhì)隨著蒸餾過(guò)程的推進(jìn)逐漸被蒸餾出來(lái)。因此，高品質(zhì)的威士忌需要摘取餾分的特定部分[11，22]。

圖2 威士忌蒸餾過(guò)程中餾分酒精度（A）及酸類物質(zhì)（B）的變化Fig.2 Changes of alcohol content (A) and acids (B) of distillates during whisky distillation process

由圖2B可知，在餾分組成中可檢測(cè)到乙酸、丙酸和乳酸3種酸類物質(zhì)，其中乙酸和丙酸僅在餾分1中檢測(cè)到，含量分別為1.714 g/L和0.29 g/L。在餾分2～11中均未能檢測(cè)到乙酸、丙酸和乳酸。這表明三種酸類物質(zhì)在蒸餾的初期就已經(jīng)被蒸餾出，可能對(duì)后期威士忌的桶陳貢獻(xiàn)不大。因?yàn)槎鄶?shù)廠家都將蒸餾初期的餾分作為酒頭予以摘除[9，11，22]。因此，分析餾分中酸類物質(zhì)的分布情況對(duì)確定高品質(zhì)餾分段具有重要意義[13，22]。

2.4 餾分中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

2.4.1 餾分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)氣味活度值

餾分中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示，共檢測(cè)出51種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，計(jì)算OAV，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2威士忌蒸餾過(guò)程中餾分中揮發(fā)性風(fēng)味化合物氣味活度值變化Table 2 Changes of odor activity values of volatile flavor compounds in distillates during whisky distillation process

醇類物質(zhì)是威士忌酒的基本香氣化合物，這些物質(zhì)主要來(lái)源于酵母發(fā)酵麥汁（谷物糖化液）過(guò)程中氨基酸代謝或糖代謝產(chǎn)物。由表2可知，餾分1～11中共檢出9種醇類化合物，其中，異戊醇、反式-橙花叔醇、金合歡醇、月桂醇是餾分1～11共有。異戊醇OAV最高，分別為16.75（餾分1）、8.67～12.77（餾分2～8）、6.16～7.81（餾分9～11），異戊醇可賦予威士忌雜醇味、發(fā)酵味、果味、香蕉味、輕微白蘭地味。反式-橙花叔醇、金合歡醇和月桂醇在餾分1～11中OAV均＞1，可賦予威士忌青草味、花果味、柑橘味、蠟味、油膩味、香菜味、金屬味、肥皂味、醛味、泥土味等風(fēng)味特點(diǎn)。此外，1-癸醇和乙縮醛OAV值也較高，在蒸餾過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，可賦予威士忌青草味、脂肪味、多汁柑橘味等風(fēng)味特點(diǎn)。

酮類和醛類化合物也是威士忌酒香氣的主要貢獻(xiàn)者。酮類化合物賦予產(chǎn)品花香味、果味和脂肪味。餾分中共檢出1種酮類化合物，為大馬士酮；其中餾分9～11中大馬士酮的OAV最高，為733.59～885.61，能賦予威士忌蘋(píng)果味、玫瑰味、蜂蜜味、香煙味、甜味的風(fēng)味特點(diǎn)。

酯類物質(zhì)是威士忌酒的重要香氣物質(zhì)，主要產(chǎn)生于酵母的麥汁（谷物糖化液）酒精發(fā)酵及橡木桶桶陳過(guò)程，能賦予威士忌酒濃郁的花香和果香。餾分1～11中共檢出30種酯類化合物，棕櫚酸乙酯、月桂酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯、辛酸異戊酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、庚酸乙酯、丁酸乙酯、醋酸辛酯、2-甲基丁酸乙酯共15種物質(zhì)是蒸餾液中OAV＞1的化合物，其中乙酸異戊酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、棕櫚酸乙酯共7種物質(zhì)是所有餾分共有的風(fēng)味酯類物質(zhì)，其中辛酸乙酯的OAV最高，分別為2 268.90（餾分1）、210.79～717.63（餾分2～8）、68.53～240.44（餾分9～11），可賦予威士忌蠟味、果味（葡萄酒味、菠蘿味）、奶油脂肪味、肥皂味、白蘭地味。己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和月桂酸乙酯在威士忌不同時(shí)間餾分中OAV也較高，賦予威士忌甜味、果味（菠蘿味、蘋(píng)果味、葡萄味、香蕉味）、蠟味、青草味、花香味、香料味、奶油脂肪味、白蘭地味等風(fēng)味特點(diǎn)。此外，棕櫚酸甲酯、異戊酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯是餾分1中特有的風(fēng)味物質(zhì)，能賦予威士忌油味、蠟味、脂肪味、水果味（葡萄味、菠蘿味、芒果味、櫻桃味）。苯甲酸乙酯、戊酸乙酯和辛酸甲酯是餾分2～6中特有的風(fēng)味物質(zhì)，能賦予威士忌甜味、青草味、果味（菠蘿味、草莓味、柑橘味）、臘味、脂肪味等風(fēng)味特點(diǎn)。

餾分1～11中共檢出5種醛類化合物，乙縮醛為餾分1～10所共有，OAV分別為36.44（餾分1）、0.70～24.72（餾分2～8）、0.68～1.14（餾分9～10），能賦予威士忌奶油、水果、宜人的熱帶水果味。肉豆蔻醛是餾分1中特有的OAV＞1的風(fēng)味物質(zhì)，能賦予威士忌乳酸味、椰子味、木制和魚(yú)腥味、輕微果味。椰子醛是餾分10～11中共有的OAV＞1的風(fēng)味物質(zhì)，能賦予威士忌椰子味、桃味、杏味。

2.4.2 餾分關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)層次聚類分析

聚類分析是利用合并算法來(lái)計(jì)算各變量間的距離的一種分析方法。變量間距離越小，相似度越高。本研究對(duì)不同餾分中OAV＞1的35種關(guān)鍵風(fēng)味化合物進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同餾分中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)層次聚類分析結(jié)果Fig.3 Hierarchical cluster analysis results of key flavor compounds in different distillates

由圖3可知，11個(gè)餾分可分為3大類：第一大類包括餾分1，第二大類包括餾分2～6，第三大類包括餾分7～11。

35種風(fēng)味化合物同樣被分為3大類：第一大類包括己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯在內(nèi)的20種風(fēng)味化合物，這些物質(zhì)OAV較高，呈現(xiàn)蠟味、果味（蘋(píng)果味、香蕉味）、甜味、青草味、奶制品味等風(fēng)味特點(diǎn)，是第一大類（餾分1）的分類依據(jù)。第二大類包括辛酸異戊酯、1-癸醇在內(nèi)的7種風(fēng)味化合物，這些物質(zhì)OAV較高，呈現(xiàn)果味（柑橘味、椰子味）、青草味、脂肪味、甜味、蠟味等風(fēng)味特點(diǎn)，是第二大類（餾分2～6）的分類依據(jù)。第三大類包括反式-橙花叔醇、大馬士酮在內(nèi)的8種風(fēng)味化合物，呈現(xiàn)青草味、木頭味、蘋(píng)果味、玫瑰味、蜂蜜味、香煙味、甜味等風(fēng)味特點(diǎn)，這是第三大類（餾分7～11）的分類依據(jù)。威士忌樣本之間的關(guān)系被分為3大類，第一大類包括酒頭、第二大類包括酒心1～5，第三大類包括酒心6～7和酒尾1～3。層次聚類分析結(jié)果表明，可以依據(jù)揮發(fā)性風(fēng)味成分組成區(qū)分不同餾分。

2.4.3 餾分關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)主成分分析

為進(jìn)一步揭示威士忌餾分之間的風(fēng)味差異，采用主成分分析法分析了不同餾分中OAV＞1的35種關(guān)鍵風(fēng)味化合物，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同餾分中關(guān)鍵風(fēng)味化合物主成分分析得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.4 Score plot (A) and loading plot (B) of principal component analysis of key flavor compounds in different distillates

由圖4可知，主成分（principal component，PC）1（PC1）和主成分2（PC2）方差貢獻(xiàn)率分別為57.6%和21.4%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為79.0%，足以區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)威士忌的香氣特征。不同餾分分別位于三個(gè)明顯不同的區(qū)域，其中區(qū)域①包括餾分1，與二甲硫醚、月桂酸、己酸乙酯等物質(zhì)接近；區(qū)域②包括餾分2～6，與1-癸醇、異丁醇等物質(zhì)靠近；區(qū)域③包括餾分7～11，與二甲基二硫醚、椰子醛等物質(zhì)接近。

由圖4A可知，餾分1與餾分2～6、餾分7～11區(qū)別在PC1上，其中餾分1分布在PC1正半軸，餾分1與餾分7～11在PC1負(fù)半軸；區(qū)域②與區(qū)域③區(qū)別在PC2上，其中②分布在PC2負(fù)半軸，③分布在PC2正半軸。由圖4B可知，隨著酒精度的降低，餾分2～6（PC2負(fù)半軸）中的物質(zhì)正辛醇、1-癸醇逐漸被二甲硫醚、椰子醛等物質(zhì)取代，變?yōu)轲s分7～11（PC2正半軸）。

一般載荷矩陣數(shù)值越高被認(rèn)為越重要，前兩個(gè)因子的載荷矩陣見(jiàn)表3。由表3可知，乙醛、棕櫚酸甲酯、異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、二甲硫醚、肉豆蔻醛、庚酸乙酯、月桂醇、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、辛酸乙酯、醋酸辛酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、月桂酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、乙縮醛、異戊醇共20種物質(zhì)與PC1呈正相關(guān)，這些是餾分1中的特征物質(zhì)，風(fēng)味呈現(xiàn)多樣化。正辛醇與PC2呈負(fù)相關(guān)，是餾分2～6中的特征化合物，主要呈現(xiàn)蠟味、青草味、柑橘味、橙子和醛類香味、輕微果味等風(fēng)味特點(diǎn)，反式-橙花叔醇與PC2呈正相關(guān)，是餾分7～11中的特征化合物，主要呈現(xiàn)青草味、花味、木頭味、果味、柑橘味、甜瓜味等風(fēng)味特點(diǎn)。

表3 不同餾分中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)主成分載荷矩陣Table 3 Loading matrix of principal component analysis of key flavor compounds in different distillates

3 結(jié)論

本研究通過(guò)分析威士忌制備過(guò)程中理化指標(biāo)及風(fēng)味物質(zhì)變化，揭示了原酒漿和蒸餾餾分的物質(zhì)變化和風(fēng)味形成規(guī)律。原酒漿中共檢出44種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，蒸餾餾分共檢出51種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。酒精度及4種風(fēng)味貢獻(xiàn)度最大的酯類物質(zhì)（癸酸甲酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯）OAV在發(fā)酵過(guò)程中呈先上升后下降趨勢(shì)，第2天達(dá)到最大值。蒸餾餾分隨蒸餾時(shí)間的增加酒精度呈下降趨勢(shì)。基于餾分關(guān)鍵風(fēng)味化合物（OAV＞1），通過(guò)聚類分析及主成分分析可區(qū)分不同餾分，通過(guò)風(fēng)味物質(zhì)分析和主成分分析可為蒸餾過(guò)程中酒頭、酒心及酒尾的摘取，提供最直接的數(shù)據(jù)支撐。