瀘州產區濃香型白酒釀造微環境-風味相關性分析

賀雨杰，唐雨潤，蔣小清，郭晴艷，2*

（1.西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2.西華大學 食品微生物四川省重點實驗室，四川 成都 610039）

中國白酒是一種傳統的酒精飲料，擁有2 000多年歷史，也是世界六大蒸餾酒之一[1]。根據白酒的主要香氣特征，可以將其劃分為12種香型，其中濃香型、醬香型、清香型和米香型被廣泛認為是四種基本香型。濃香型白酒作為四種基本香型之一，具有窖香濃郁、純正和諧、香氣協調、回味悠長的典型特征，其銷售份額約占中國白酒總產量或市場份額的70%，深受廣大飲酒者的喜愛[2]。濃香型白酒是以谷物為原料，以濃香型大曲為糖化劑，在窖池內經固態發酵、固態蒸餾、陳釀、勾兌等工序制得的白酒[3]。其原名為瀘香型白酒，是根據著名濃香型白酒品牌“瀘州老窖”的特點命名的，從20世紀80年代才開始被稱為濃香型白酒。根據地區和白酒風格，濃香型白酒可以分為不同流派，包括四川流派、江淮流派和北方流派。四川流派是濃香型白酒的起源地，一半的高質量濃香型白酒品牌都產自該地區[4]。其中，瀘州素有“中國酒城”之稱，是川酒四大主產區之一，在中國濃香型白酒產業中具有特殊的重要性。

濃香型白酒在開放環境中生產，經不同微生物的代謝產生酒精和香氣成分。微生物在白酒風味物質和風味類型的形成中起著決定性的作用，而所有微生物都直接或間接來自于環境并構成了由生產技術和環境生態調節的發酵微環境[5-7]。白酒發酵微環境是白酒發酵環境的重要組成部分，也是影響白酒質量安全和風味特征的重要因素[8]。發酵微環境包括糧食原料在操作過程中直接或間接接觸的所有環境，包括但不限于土壤、用水、空氣、工人等因素。研究表明，不同地區生產的醬香型白酒發酵谷物中的微生物群落組成有很大差異，這可能是其獨特風味的部分原因[9-10]。HU Y L等[11]利用高通量測序技術研究了米香型白酒生產過程中微生物群落的變化，研究表明，各種主要微生物均來自于環境和大米原料，且溫度和總酸含量是影響微生物組成的主要物理化學因素。此外，大曲和窖泥均對發酵谷物中的原核生物群落產生影響，窖泥中的厭氧菌可以遷移到糟醅中，并促進有機酸和風味化合物的生成[12]。LIU M K等[13]通過高通量測序對瀘州老窖使用了40年和400年的窖池中細菌群落多樣性和新穎性展開探究。結果表明，瀘州老窖窖泥中的11個優勢細菌屬可能在中國濃香型白酒生產中發揮重要作用，且產己酸菌屬（Caproiciproducens）在400年窖池中豐度顯著增加，為瀘州地區濃香型白酒特征性風味的形成奠定生物基礎。因此，探究濃香型白酒發酵微環境與風味的相關性是提高白酒生產質量和可控性的關鍵。

本研究采用高通量測序技術分別對瀘州產區濃香型白酒廠來源大曲、糟醅和窖泥以及環境樣本中的微生物群落進行檢測，進一步利用頂空固相微萃取結合全二維氣相色譜-質譜聯用技術（headspace solid-phase microextractioncomprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC×GC-MS）檢測大曲、糟醅、窖泥和原酒中的揮發性風味物質，基于相關性分析探究瀘州產區濃香型白酒微環境與特征性風味的相關性，闡明其作用網絡，以期揭示瀘州產區濃香型白酒風味密碼，為實現濃香型白酒的質量控制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲、糟醅、窖泥和原酒樣品：取自四川省瀘州市3家濃香型白酒廠（分別編號為1、2、3），其中大曲樣品采用五點取樣法采集曲房內穩定儲存的大曲（D1、D2、D3）；糟醅樣品為對上、中、下3個位置的內層和外層分別取樣，混合為1個樣品（Z1、Z2、Z3）；窖泥樣品采用五點取樣法分別對窖池四周和中心點取樣并混合為1個樣品（J1、J2、J3）；原酒樣品編號為B1、B2、B3；土壤樣品取自白酒廠內空地，去除部分可見雜質（RW）；水體樣品分別取自白酒廠釀造用水（FW）和瀘州內長江（RW），各選3個取樣點；每個樣品采集3個平行樣品，取樣后使用無菌封口袋密封，經干冰保存運輸至實驗室，置于-80 ℃冰箱儲存。

50×三羥甲基氨基甲烷-乙酸鹽-乙二胺四乙酸緩沖液、2×San·Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）預混液、4SGreenPlus無毒核酸染料、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker 2 000：生工生物工程（上海）股份有限公司；2-辛醇（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉（分析純）：福晨化學試劑有限公司；E.Z.N.A.R土壤DNA試劑盒：美國Omega生物技術公司；革蘭氏染色液試劑盒：北京索萊寶有限公司；DB蠟質石英毛細管柱、DB-17MS毛細管柱：安捷倫科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Easycycle Gradient梯度PCR儀、BDA Box 2凝膠成像分析系統：德國耶拿分析儀器股份公司；DYY-8C雙定時電泳儀：北京市六一儀器廠；QP2020NX氣質聯用儀：島津（上海）實驗器材有限公司；SB-5200DT超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；57330-U手動固相微萃取進樣手柄、57329-U二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carbo-xen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭：德國默克公司；WFJ7200紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；PHS-320高精度智能酸度計：成都世紀方舟科技有限公司；QuantiFluorTM-ST熒光計：普洛麥格（北京）生物技術有限公司；固態熱調制器HV（c720-21005）：雪景電子科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基本理化指標測定

根據QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》對樣品pH值、水分、總酸、還原糖以及淀粉含量進行檢測。pH值：pH計測定；水分含量：直接干燥法測定；總酸：氫氧化鈉滴定法測定；還原糖：直接滴定法測定；淀粉含量：酸水解法測定。

1.3.2 高通量測序

根據E.Z.N.A.R土壤DNA試劑盒操作說明進行微生物DNA提取，分析DNA濃度和純度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA完整性。使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進行細菌16S rRNA基因序列擴增，其PCR擴增體系包括4 μL 5FastPfu緩沖液、2 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（2.5 mmol/L）、0.4 μL FastPfu聚合酶、0.2 μL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、0.8 μL引物338F（5 μmol/L）、0.8 μL引物806R（5 μmol/L）以及10 ng 模板DNA，并用雙蒸水（ddH2O）補充至體系總體積為20 μL，PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，升溫至72 ℃延伸45 s，重復30個循環；然后在72 ℃維持10 min以進一步延伸，最后降溫至10 ℃并人工終止程序。使用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）進行真菌ITS基因序列擴增，其PCR擴增體系包括4 μL 5FastPfu緩沖液、2 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.4μLrTaq聚合酶、0.2μLBSA、0.8μL引物ITS1F（5μmol/L）、0.8 μL引物ITS2R（5 μmol/L）以及10 ng模板DNA，并用ddH2O補充至體系總體積為20 μL，擴增程序與細菌一致。進一步利用2%瓊脂糖凝膠分離和提取擴增產物，通過DNA凝膠提取試劑盒進行純化，最后利用熒光系統進行定量分析，將符合要求的樣品置于-80 ℃儲存。

測序得到的原始數據（Raw Reads）通過Trimmomatic v0.33軟件進行過濾處理，之后通過cutadapt 1.9.1軟件進行引物序列的識別和去除，得到不包含引物序列的高質量序列數（Clean Reads）。使用Usearch v10軟件對樣品Clean Reads進行拼接，并根據不同區域長度范圍進行拼接和長度過濾。去除標簽序列以及長度小于200 dp、平均值得分低于20分或含有模糊堿基對的低質量序列。使用QIIME2（版本2020.6）軟件對嵌合體序列進行去噪和消除，按照97%成對同一性的閥值將優質序列進行歸類，形成最終有效數據去除嵌合體后的序列條數（Non-chimeric Reads）。最后對來自細菌和真菌的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）代表序列使用Silva 138 16S rRNA數據庫（http：//www.arb-silva.de）和Unite 8.0 ITS數據庫（http：//unite.ut.ee/）作為相應比較數據庫，使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進行分類學注釋。

1.3.3 揮發性風味化合物測定

采用HS-SPME-GC×GC-MS法檢測原酒樣品中揮發性風味化合物[14]。

窖泥和糟醅樣品預處理：準確稱取2.000 g樣品、1.500 g氯化鈉和5.00 mL蒸餾水，混合，然后轉移到15 mL SPME瓶中。將樣品置于30 ℃的水浴中超聲（240 W）處理30 min，加入20 μL質量濃度為0.822 mg/mL的2-辛醇（蒸餾水溶解）作為內標。為使化合物充分揮發，進一步將樣品置于60 ℃的水浴中平衡15 min，然后向該SPME瓶中插入75 μm的DVB/CAR/PDMS涂層的SPME纖維探頭，以吸收瓶中的揮發性成分，該吸附過程持續45 min。之后，將該纖維探頭插入氣相色譜儀的注入口，進行1 min的解吸附。

原酒樣品預處理：移取5.00 mL樣品于15 mL SPME瓶中，加入3.000 g氯化鈉和5 μL 2-辛醇，混合，其他與預處理步驟同上。

GC×GC-MS條件：一維色譜柱由DB蠟質石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）組成，二維色譜柱由DB-17MS毛細管柱（1.2 m×0.18 mm×0.18 mm）組成，應用固態熱調制器HV（c720-21005），用高純氦氣（He）（純度≥99.999%）作為載氣，流速為1.0 mL/min。溫度程序為40 ℃下保持2 min，之后以6 ℃/min的速度升至230 ℃，同時設置烘箱溫度為230 ℃，二維分析時間與一維柱同步，調制周期為4 s。

定性定量分析：通過比較美國國家標準與技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）質譜庫中參考標準的保留指數和質譜對揮發性化合物進行鑒定；使用內標法對所鑒定的風味物質進行半定量分析[15]。

1.3.4 數據處理

每個實驗獨立重復3次（n=3）。使用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析，然后進行鄧肯多重范圍檢驗。采用Excel 2019對風味化合物重復值進行處理。使用OriginPro 2019軟件對數據進行圖形處理。P值＜0.05被用來表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 瀘州產區濃香型白酒釀造微環境分析

微生物相互作用模式很大程度上取決于它們所處的環境，環境條件的變化可能導致群落協作或競爭性相互作用的改變，同時環境條件的變化也是微生物內部相互作用結果的體現[16-17]。瀘州產區濃香型白酒廠來源大曲、糟醅和窖泥的理化指標檢測結果見圖1。

圖1 瀘州產區濃香型白酒大曲、糟醅和窖泥樣品的理化指標檢測結果Fig.1 Physicochemical indexes determination results of strong-flavor Baijiu Daqu, Zaopei and pit mud samples in Luzhou production area

由圖1a可知，大曲樣品pH值為6.55～6.68，呈弱酸性；糟醅中pH值較低，僅為3.05～3.23，有利于耐酸性菌的篩選和后續發酵優勢菌株的形成；窖泥樣品的pH值為5.08～5.21，位于大曲和糟醅之間。

酸度是有機酸總量的體現，而有機酸作為窖泥風味分析中的主要物質以及最終香氣呈現的前體物質，是衡量窖泥品質的重要指標。窖泥的高酸度使產酸細菌在其內部富集生長，最終成為優勢細菌群落，為濃香型白酒特征性風味的形成做出積極貢獻。由圖1b可知，大曲樣品的酸度最低，為0.60～0.73 mmol/10 g；糟醅酸度為1.83～2.20 mmol/10 g；窖泥酸度明顯高于大曲和糟醅，達到6.87～7.63 mmol/10 g，大曲內部的弱酸性條件為微生物的適應性生長提供了良好的基礎。

由圖1c可知，糟醅和窖泥的還原糖含量分別為2.77～3.00 g/100 g、2.77～2.93 g/100 g，大曲中還原糖含量為4.83～6.17 g/100 g，表征大曲較高的糖化能力，可為后續發酵提供充足動能。

由圖1d可知，糟醅中水分含量是評價環境濕度和樣品質量的重要指標之一，窖泥、大曲的水分含量分別為52.20%～58.13%、8.73%～9.37%，糟醅中水分含量較高，達到48.73%～58.67%，為微生物的生長提供充足的水分條件。

以上結果初步刻畫了瀘州產區釀造微環境的特點，其合適的pH值、酸度、還原糖以及水分含量有效推動內部微生物區系的構建和穩定繁殖，為該產區濃香型白酒特征性風味的形成奠定堅實的環境基礎。

2.2 瀘州產區濃香型白酒釀造微環境微生物分析

2.2.1 細菌群落Alpha多樣性分析

Chao1指數和基于豐度的覆蓋估計值（abundance-based coverage estimator，ACE）指數表征物種豐富度，而Shannon指數和Simpson指數表征物種多樣性。對瀘州產區濃香型白酒廠來源大曲、糟醅、窖泥樣品以及釀造水體、環境水體、廠區土壤樣品的微生物菌群進行測序分析，其細菌群落Alpha多樣性分析結果見表1。

表1 細菌群落Alpha多樣性分析結果Table 1 Alpha diversity analysis results of bacterial community

由表1可知，土壤樣品Chao1指數和ACE指數分別為2 662.03和2 663.34，Shannon指數和Simpson指數分別為10.50和1.00，均高于其他樣品，表征其細菌群落豐富度和多樣性最高。窖泥樣品Chao1指數和ACE指數分別為501.14～512.20和509.88～515.89，Shannon指數和Simpson指數分別為6.01～6.47和0.93～0.98，均低于其他樣品。此外，釀造水體和環境水體樣品中細菌群落豐富度和多樣性（Chao1指數分別為1 262.55、2 352.29，ACE指數分別為1 274.27、2 358.57，Shannon指數分別為7.88、9.20，Simpson指數均為0.99）均高于大曲、糟醅和窖泥樣品，表明濃香型白酒釀造過程中細菌群落從土壤和水體向大曲、糟醅和窖泥轉移的過程中伴隨著微生物的演替，其中的優勢細菌群落最終占據發酵微環境中的生態位，形成濃香型白酒釀造的優勢細菌群。

2.2.2 細菌群落結構分析

基于屬水平不同樣品的細菌菌群結構以及層次聚類分析熱圖見圖2。由圖2a可知，針對所有樣品，在屬水平上平均相對豐度排名前10的屬分別是醋酸乳桿菌屬（Acetilactobacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、喜熱菌屬（Caloramator）、水楊酸沉積桿菌屬（Sedimentibacter）、白腐菌屬（Petrimonas）和部分未分類的梭菌目（unclassified_Clostridiales）、未分類的厚壁菌門（unclassified_Firmicutes）、未分類的瘤胃球菌科（unclassified_Ruminococcaceae）、未分類的細菌（unclassified_Bacteria）。其中，大曲中魏斯氏菌屬相對豐度最高，達52.28%。相較于四川其他產區，瀘州產區濃香大曲中魏斯氏菌屬相對豐度更高，這可能有助于解釋瀘州產區濃香型白酒的特征性風味[18]。大曲、糟醅和窖泥中均檢出較高相對豐度的白腐菌屬（分別為6.71%、3.60%和22.79%）。白腐菌屬是一種來源于環境的嗜溫發酵細菌屬，有利于代謝活動的推進并創造適合于發酵的厭氧環境[19]，促進窖池發酵階段合適發酵環境的形成。此外，大曲、糟醅和窖泥中均檢測到高豐度的乳桿菌屬，分別為6.06%、63.09%和13.51%。研究表明，大曲發酵早期的高酸高溫環境主要是由乳桿菌屬的代謝活動引起的，有助于大曲微生物群落的自我凈化和優勢微生物群的形成和穩定[20]。在發酵后期，糟醅中乳酸菌大量富集并代謝產生乳酸，進一步代謝可產生乳酸菌素、有機酸等抗菌物質，有助于釀造微環境的穩定，對后續風味物質的形成與累積至關重要。

圖2 基于屬水平不同樣品的細菌菌群結構（a）及層次聚類分析熱圖（b）Fig.2 Bacterial community structure of different samples based on genus level(a)and heat map for hierarchical cluster analysis(b)

在此基礎上，針對12個樣本中檢測到的所有細菌屬進行物種豐度聚類分析，結果見圖2b。由圖2b可知，大曲樣品分別與糟醅、窖泥、土壤和釀造用水聚類，表明土壤和水體中微生物向大曲、大曲中微生物向糟醅和窖泥的轉移。此外，窖泥樣本先與糟醅發生聚類，之后與大曲聚類，最后與水體和土壤聚類，表明在濃香型白酒釀造過程中，土壤和水體中的微生物通過制曲過程向大曲內部遷移，進一步經堆積發酵轉移至糟醅內部，最后經窖池內發酵向窖泥內遷移，并在該演替過程中逐漸形成特征性優勢細菌群落。

由此可知，在瀘州產區特征性生態環境作用下，形成了瀘州產區濃香型白酒特征性的釀造微環境，并長時間的演替形成穩定的優勢細菌群落，在濃香型白酒釀造過程中相互作用，最終有效推動該產區濃香型白酒特征性風味的形成。

2.2.3 真菌群落Alpha多樣性分析

瀘州產區濃香型白酒廠來源大曲、糟醅、窖泥樣品以及釀造水體、環境水體、廠區土壤樣品中真菌群落Alpha多樣性分析結果見表2。由表2可知，土壤樣品Chao1指數和ACE指數分別為664.13和664.87，均高于其他樣品，表征其具有最高的物種豐富度，窖泥樣品次之（Chao1指數和ACE指數分別為510.44～525.87和522.78～536.67）。此外，大曲樣品Shannon指數和Simpson指數分別為7.33～7.80和0.99，為所有樣品中最高，表明其物種多樣性最高，土壤樣品次之（Shannon指數和Simpson指數分別為7.43和0.98）。由此可知，大曲制作過程中的半開放環境使來自環境、原料等的各種真菌在其內部富集，為濃香型白酒的釀造提供生物基礎。

表2 真菌群落Alpha多樣性分析結果Table 2 Alpha diversity analysis results of fungal community

2.2.4 真菌群落結構分析

基于屬水平不同樣品的真菌菌群結構以及層次聚類熱圖見圖3。由圖3a可知，針對所有樣品，在屬水平上平均相對豐度排名前10的屬分別是嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、邁耶氏酵母屬（Meyerozyma）、根毛霉屬（Rhizomucor）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、籃狀菌屬（Talaromyces）、嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces）未分類真菌（unclassified_Fungi）以及未分類菌屬（unidentified）。

圖3 基于屬水平不同樣品的真菌菌群結構（a）及層次聚類分析熱圖（b）Fig.3 Fungal community structure of different samples based on genus level(a)and heat map for hierarchical cluster analysis(b)

所有樣品中均檢出嗜熱子囊菌屬，且在大曲、窖泥和糟醅中相對豐度分別達到93.64%、36.27%和28.86%。嗜熱子囊菌屬代謝產生的木聚糖酶可耐受濃香型白酒發酵的高溫環境并保持較高的催化效率，保證發酵過程中的高淀粉利用率，有效提高出酒品質[21]。研究發現，四川遂寧產區和瀘州產區大曲真菌群落中嗜熱子囊菌屬豐度存在顯著差異[18]。所有樣品中均檢出曲霉屬，在大曲、窖泥、糟醅中的相對豐度分別達到28.25%、21.59%和14.41%，其代謝產生的酯化酶和糖化酶可有效推動濃香型白酒風味前體物質的形成。但是，與江淮產區大曲真菌群落相比，瀘州產區大曲中曲霉屬豐度較低，這可能與不同地區制曲環境溫度有關[22]。此外，糟醅中的優勢菌屬是哈薩克斯坦酵母屬，相對豐度高達32.99%，其有利于發酵過程中乙醇的產生和有機酸的積累[23]。據報道，瀘州產區糟醅中哈薩克斯坦酵母屬豐度與水分含量顯著相關[24]，一定程度上解釋了發酵環境與微生物篩選的相關性。窖泥中的優勢菌屬是邁耶氏酵母屬，相對豐度高達34.44%，其多來源于環境。梁歡[25]比較了瀘州產區和北方產區窖泥真菌群落，發現其優勢菌株存在明顯的地區差異性，其中邁耶氏酵母屬差異顯著，這可能是由于不同地區環境差異所導致的。

由圖3b可知，不同種類樣品聚類不明顯，大曲、糟醅和窖泥的真菌群落相似性較高，而水體和土壤樣本中真菌群落有顯著差異。由此可知，在瀘州產區濃香型白酒釀造過程中，水體和土壤來源真菌向大曲、糟醅和窖泥中遷移并經長時間的演替，最終形成特征性真菌群落，且其優勢真菌菌群在不同釀造微環境中具有相似性，表征優勢真菌群落的穩定性，保證了瀘州產區濃香型白酒特征性風味的形成。

因此，具有最高物種多樣性的大曲是瀘州產區濃香型白酒釀造微環境中真菌群落富集與演替的基礎，并進一步向糟醅和窖泥中遷移，對特征性真菌群落的形成和穩定具有重要作用，進一步保證了該產區濃香型白酒特征性風味的形成。

2.3 瀘州產區濃香型白酒揮發性風味化合物分析

基于HS-SPME-GC×GC-MS對瀘州產區濃香型白酒廠來源大曲、窖泥、糟醅及原酒的揮發性風味物質進行檢測，結果見圖4。由圖4可知，共檢測到182種揮發性風味化合物，包括68種酯類、27種醇類、23種酸類和64種其他化合物，其他化合物中包括少量酚類、醛類、酮類、吡嗪類、吲哚類和萜烯類化合物。

圖4 瀘州產區濃香型白酒各類別揮發性風味化合物相對含量（a）和聚類分析熱圖（b）Fig.4 Relative contents of various categories volatile flavor compounds in strong-flavor Baijiu from Luzhou producing area (a) and cluster analysis heat map (b)

由圖4a可知，不同樣本中風味化合物類別存在顯著差異，其中酯類在窖泥中相對含量最高，達到78.63%，其次是糟醅，相對含量達到54.96%。醇類在大曲中相對含量最高，達到43.57%，而酸類在糟醅中相對含量最高，達到24.65%。

在此基礎上，進一步針對不同樣品中風味化合物進行分層聚類分析，結果見圖4b。由圖4b可知，原酒中的主要風味化合物是酯類和醇類，相對含量分別高達36.05%和27.45%，其中主要包括己酸乙酯（19.18%）、棕櫚酸乙酯（9.20%）、己酸己酯（2.40%）、乙醇（8.78%）、丁醇（3.68%）、己醇（2.73%）、戊醇（1.61%）等。大曲中相對含量較高的是己酸乙酯（22.12%）、己酸己酯（17.16%）、丁酸乙酯（3.53%）、1-辛烯-3-醇（13.82%）、2,3-丁二醇（6.42%）、乙醇（4.05%）等。糟醅中的主要風味化合物是酸類和酯類物質，其中己酸乙酯（19.16%）、棕櫚酸乙酯（9.46%）、辛酸乙酯（6.29%）、己酸己酯（5.98%）、己酸（13.21%）、戊酸（2.97%）、辛酸（2.80%）和乙酸（1.90%）相對含量較高。此外，糟醅中乳酸乙酯（0.86%）相對含量明顯提高，這可能是由于開放式發酵對乳酸的堆積引起的[26]。窖泥中以酸類和酯類為主，其中乳酸乙酯（0.08%）相對含量明顯低于糟醅，其可能與厭氧發酵微生物的優勢生態位相關。由此可知，釀造環境的動態變化對原酒風味的原始積累有較強的相關性[27]。

己酸乙酯主要由酵母對酸類和醇類物質的酯化反應生產，為濃香型白酒提供重要的窖香，是評價濃香型白酒質量的關鍵指標之一。大曲、糟醅、窖泥和原酒中己酸乙酯的相對含量分別為22.12%、19.16%、14.95%和19.18%，表征其在濃香型白酒釀造過程中發生的轉化與演替。醇類在風味描述中多給人以復雜圓潤的香氣體驗，被描述為具有堅果、香蕉的香氣。瀘州產區濃香型白酒原酒中豐富的乙醇、丁醇、己醇、戊醇、丙醇、糠醇等醇類對其綿柔口感具有重要意義。瀘州產區濃香型白酒原酒中酸類的主要貢獻來自于己酸（12.93%）、乙酸（2.72%）、丁酸（2.04%）、戊酸（0.68%）、丙酮酸（0.57%）、辛酸（0.23%）、庚酸（0.15%）和乳酸（0.07%），對白酒風味有明顯的調和作用，也是酯類代謝過程中重要的前體物質。此外，原酒中還檢測出微量的醛類、吡嗪類和吲哚類化合物。微量風味化合物在整體所占比例小，但其感官閾值高，為濃香型白酒的風味感受提供關鍵的調和作用。

由此可知，瀘州產區濃香型白酒釀造微環境中微生物群落的演替伴隨著酯類、醇類、酸類等風味化合物的轉化。酯類是所有樣品中的首要風味化合物，賦予濃香型白酒甜味和果味，同時弱化氨基的苦味和脂肪酸的辛辣味，對瀘州產區濃香型白酒的特征性風味意義重大。其中，己酸乙酯、丁酸乙酯、油酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙酸乙酯等均具有重要貢獻。此外，己醇、丁醇、異戊醇、乙酸、己酸、丁酸等關鍵差異性風味化合物在不同樣本中的轉化與演替共同刻畫了濃香型白酒風味的形成過程。

2.4 瀘州產區濃香型白酒釀造微環境-風味相關性分析

為進一步探究釀造微環境對瀘州產區濃香型白酒風味的影響，分別對理化指標、微生物屬與揮發性風味物質進行Pearson相關性分析，結果見圖5。

圖5 瀘州產區濃香型白酒揮發性風味物質與理化指標（a）、微生物屬（b）的相關性分析結果Fig.5 Results of correlation analysis between volatile flavor compounds and physicochemical indexes (a) and microbial genera (b)

由圖5a可知，水分含量和酯類呈正相關，與酸類呈負相關。還原糖是代謝中的主要能量供給，其與酸類和醇類呈正相關，與大部分酯類呈負相關。進一步針對測序得到的豐度較高的細菌屬和真菌屬，通過Pearson相關系數與主要揮發性風味化合物進行相關性分析可知，細菌群落與風味化合物的相關性強于真菌（圖5b）。其中，白腐菌屬（Petrimonas）、喜熱菌屬（Caloramator）、水楊酸沉積桿菌屬（Sedimentibacter）以及未分類的厚壁菌門（unclassified_Firmicutes）、瘤胃球菌科（unclassified_Ruminococcaceae）、未分類的梭菌目（unclassified_Clostridiales）與棕櫚酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、庚酸具有明顯的正相關關系，而與丁酸乙酯、乳酸乙酯呈負相關。醋酸乳桿菌屬（Acetilactobacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）與庚醇、丙醇、乙酸、丁酸、辛酸、戊酸呈正相關，而與庚酸乙酯、辛酸乙酯呈負相關。真菌群落與關鍵酯類和酸類化合物具有相關性，其中嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、木霉屬（Trichoderma）、邁耶氏酵母屬（Meyerozyma）、根毛霉屬（Rhizomucor）與己酸乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯呈正相關關系，曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、籃狀菌屬（Talaromyces）與丙醇、乙酸、丁酸、辛酸、戊酸呈正相關。

由此可知，控制濃香型白酒釀造微環境理化特性有助于風味化合物的形成與累積，其中高pH值、低水分含量有助于醇類和酸類物質的形成，而低pH值、低酸度、高水分含量有助于酯類物質的形成。此外，白腐菌屬、喜熱菌屬、水楊酸沉積桿菌屬以及部分未分類的厚壁菌門、瘤胃球菌科和梭菌目有助于瀘州產區濃香型白酒中酯類風味化合物的形成，乙酰乳桿菌屬、乳桿菌屬、嗜熱子囊菌屬、木霉屬和籃狀菌屬有助于醇類和酸類風味化合物的形成。在合適的理化性質與優勢微生物群落的共同作用下，瀘州產區濃香型白酒特征性風味得以穩定與協調。

3 結論

本研究采用高通量測序技術和HS-SMPE-GC×GC-MS對瀘州產區濃香型白酒廠來源大曲、窖泥、糟醅以及原酒釀造微環境的微生物菌群結構及揮發性風味物質進行分析。進一步結合Pearson相關性分析闡明該地區濃香型白酒釀造微環境與特征性風味的相關性。結果表明，土壤樣本中的微生物群落豐富度和多樣性均高于大曲、糟醅和窖泥樣本，表征釀造微環境中微生物群落的演替過程。魏斯氏菌屬和嗜熱子囊菌屬分別是大曲中豐度最高的細菌屬和真菌屬，同時也是瀘州產區大曲區別于其他產區大曲的主要菌屬，為瀘州產區濃香型白酒特征性風味形成奠定物質基礎。大曲、糟醅、窖泥和原酒中風味化合物主要包括酯類、醇類和酸類，但不同樣本中風味化合物含量差異顯著。Pearson相關性分析表明，釀造微環境理化性質和微生物群落與白酒風味形成相關，且細菌群落與揮發性風味化合物的相關性強于真菌群落。其中，白腐菌屬、喜熱菌屬、水楊酸沉積桿菌屬等有助于酯類風味化合物的形成，乙酰乳桿菌屬、乳桿菌屬、嗜熱子囊菌屬等有助于醇類和酸類風味化合物的形成。本研究為瀘州產區濃香型白酒特征性風味的形成提供了理論依據，同時為后續濃香型白酒的質量控制與優化提供參考。