具有抑菌活性乳酸菌的分離、鑒定及其生長(zhǎng)特性研究

張 甜，丁真真，劉艷全，徐明宜，王繼蓮*

（1.喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844000）

漿水、酸奶、馕均為中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品，極具地方特色，廣受大眾喜愛。傳統(tǒng)發(fā)酵食品中含有多種微生物，包括乳酸菌[1]。乳酸菌作為一類通過發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌，是一種無孢子革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[2-3]，其具有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)節(jié)消化道內(nèi)菌群平衡，進(jìn)而改善胃腸道功能、提高食物消化率和生物效價(jià)、降低血清膽固醇、控制內(nèi)毒素、抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng)、加強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能[4]。

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有有機(jī)酸、細(xì)菌素和其他具有抗菌活性的物質(zhì)[5]，TODOROV S D等[6-8]從糖蜜中分離的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可產(chǎn)生抗革蘭氏陰性菌的細(xì)菌素，對(duì)腐敗菌和食源性病原體的生長(zhǎng)和繁殖有強(qiáng)烈的抑制作用。細(xì)菌素具有高效、無毒、無殘留、無耐藥性等特點(diǎn)，可以抑制多種細(xì)菌、真菌，食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)商用的細(xì)菌素有乳酸鏈球菌素（Nisin）和片球菌素（Pediocin）等[9]。目前，已有乳酸菌及其代謝產(chǎn)物在乳及乳制品、肉及肉制品、果蔬制品、水產(chǎn)品、蛋制品中的應(yīng)用報(bào)道，其在食品保鮮中起到一定效果，可作為新型生物防腐劑被開發(fā)利用[10-14]。

食品來源的乳酸菌具有安全、無害等特點(diǎn)，本研究旨在從陜西及喀什地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離篩選具有良好抑菌作用的乳酸菌，對(duì)其發(fā)酵上清液的穩(wěn)定性及其生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，并通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)篩選菌株進(jìn)行鑒定，為具有抑菌活性乳酸菌的研究和天然生物防腐劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

陜西西安農(nóng)家漿水、喀什地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶和發(fā)酵馕面團(tuán)，無菌袋取樣后置于4 ℃冰箱備用。

指示菌菌種包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）：由喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 試劑

氯化鈉、草酸、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市圣奧化學(xué)有限責(zé)任公司；核酸染料、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）裂解液：日本TaKaRa公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-2102C全溫振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SHELLABG112電熱恒溫培養(yǎng)箱：寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZF-751-2立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；5910R高速冷凍離心機(jī)：深圳市科時(shí)達(dá)電子科技有限公司；HH-S6恒溫水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司；TU-1950紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；E221生物顯微鏡：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；Mastercycler nexus PCR儀：德國(guó)Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；ZF-20D暗箱式紫外分析儀：河南省百年儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

參照黃慧福等[15]的方法，分別稱量10 g漿水、酸奶、面團(tuán)溶于90 mL無菌水中，旋渦振蕩混勻，梯度稀釋，每個(gè)樣品均稀釋10個(gè)梯度（10-1～10-10）。分別吸取3種樣品的7個(gè)稀釋梯度（10-4～10-10）的樣液200 μL，涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[16]。隨機(jī)選取單菌落于MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板交叉劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)5次得到純化菌株。將純化后的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，甘油保藏備用。

1.3.2 抑菌試驗(yàn)

（1）指示菌菌懸液的制備

以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌3種微生物作為指示菌，將斜面保藏的菌株接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃條件下活化培養(yǎng)兩次。挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，用0.85%的滅菌生理鹽水將指示菌濃度稀釋至108CFU/mL，得到指示菌菌懸液[17]。

（2）發(fā)酵上清液制備

將篩選純化的單菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h，得到發(fā)酵液。發(fā)酵液于4 ℃、14 000 r/min離心10 min，得發(fā)酵上清液，置于4 ℃冰箱備用[18]。

（3）發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的測(cè)定[19-22]

抑菌乳酸菌的篩選：吸取100 μL 3種指示菌菌懸液，分別涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。將涂布好的培養(yǎng)皿劃分為四個(gè)區(qū)域，分區(qū)域放入滅菌牛津杯，再吸取200 μL各菌株的發(fā)酵上清液滴入牛津杯，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈。測(cè)量抑菌圈的直徑，篩選出抑菌圈較大的菌株。

發(fā)酵產(chǎn)物酸堿處理后的抑菌試驗(yàn)：用1 mol/L的草酸溶液和1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液的pH至2.0和9.0，其中一組保持2 h后再調(diào)回其初始pH，另一組保持pH至2.0和9.0，測(cè)量抑菌圈的直徑。

發(fā)酵產(chǎn)物熱處理后的抑菌試驗(yàn)：分別將發(fā)酵上清液經(jīng)60 ℃和100 ℃處理15 min，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.3 篩選菌株的生長(zhǎng)特性

生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力測(cè)定[19，23]：按2%的接種量將篩選乳酸菌菌株的菌液接種于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值（OD600nm值）和pH，繪制生長(zhǎng)曲線和pH變化曲線。

抑菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)[19]：按2%的接種量將篩選乳酸菌菌株的菌液接種于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，測(cè)定其發(fā)酵上清液對(duì)指示菌的抑菌圈直徑，并繪制抑菌動(dòng)力學(xué)曲線。

耐酸堿試驗(yàn)[24-25]：用1 mol/L的草酸溶液和1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基的pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按2%的接種量將篩選乳酸菌菌株的菌液接種于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后測(cè)定發(fā)酵液的OD600nm值。

耐滲透壓試驗(yàn)[25]：按2%的接種量將篩選乳酸菌菌株的菌液接種于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別添加氯化鈉含量至0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液的OD600nm值。

1.3.4 篩選菌株的分子生物學(xué)鑒定

用滅菌牙簽挑取乳酸菌單菌落于50 μL裂解液中，充分混勻，90 ℃水浴裂解15 min得到脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，利用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA模板2μL、引物各2μL、2×PowerTaqPCR MasterMix 25 μL、補(bǔ)充雙蒸水（ddH2O）至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存[26]。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，返回的基因序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知序列進(jìn)行同源比對(duì)，利用MEGA 11.0軟件中的鄰接法（neighbor joining，NJ）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[27]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每一組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS Statistics 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用單因素方差分析和Duncan多范圍檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)之間的顯著性差異（P＜0.05），采用Origin 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

稀釋涂布后和交叉純化的菌落見圖1。由圖1可知，各菌落間形態(tài)差異較小，乳酸菌單菌落均呈乳白色圓球狀，其質(zhì)地圓潤(rùn)光滑，具有光澤。

圖1 部分乳酸菌的分離純化結(jié)果Fig.1 Isolation and purification results of some lactic acid bacteria

2.2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 具有抑菌活性乳酸菌的篩選

采用牛津杯法共篩選出15株具有抑菌能力的菌株，編號(hào)為Y1～Y15，結(jié)果見表1。由表1可知，所有菌株對(duì)大腸桿菌、普通變形桿菌和枯草芽孢桿菌這三種指示菌中的一種或多種具有抑菌能力，從中挑選出抑菌圈直徑＞13 mm且能夠同時(shí)抑制3種指示菌的4株菌株Y1、Y4、Y14和Y15進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表1 篩選乳酸菌菌株發(fā)酵上清液的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of screened lactic acid bacteria supernatant

2.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)酸堿及高溫處理后的抑菌效果

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)酸堿、高溫處理后的抑菌效果見表2～表4。由表2～表4可知，4株菌株經(jīng)高溫處理后抑菌圈直徑明顯減小，抑菌效果降低，且溫度越高，抑菌效果越弱。菌株Y1在60 ℃、100 ℃處理后對(duì)大腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌活力保持在69%以上，但菌株Y4、Y14、Y15經(jīng)100℃處理后對(duì)大腸桿菌的抑菌能力均消失，菌株Y4、Y14對(duì)普通變形桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活力保持在69%以上。

表2 不同條件下乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of lactic acid bacteria supernatant on Escherichia coli under different conditions

表3 不同條件下乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)普通變形桿菌的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of lactic acid bacteria supernatant on Proteus vulgaris under different conditions

表4 不同條件下乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of lactic acid bacteria supernatant on Bacillus subtilis under different conditions

大部分菌株發(fā)酵上清液經(jīng)酸堿處理再調(diào)回原始pH后的抑菌效果明顯減弱，菌株Y1、Y14、Y15發(fā)酵上清液經(jīng)酸堿處理后抑菌活力仍保持在67%以上，且除菌株Y15外，酸處理再調(diào)回后的抑菌效果小于堿處理再調(diào)回后的抑菌效果，尤其是菌株Y4，其經(jīng)酸處理調(diào)回后對(duì)普通變形桿菌的抑菌活力消失，表明酸處理?xiàng)l件下會(huì)降低發(fā)酵液的抑菌活性。部分菌株經(jīng)堿處理再調(diào)回后抑菌圈略有增大，可能是因?yàn)樘幚? h后調(diào)回原始pH時(shí)添加的無機(jī)酸起到了抑菌效果。4株菌株發(fā)酵上清液pH調(diào)至2時(shí)抑菌圈明顯增大，表明調(diào)酸后添加的無機(jī)酸增加了抑菌效果，pH調(diào)至9時(shí)抑菌活性均較少甚至消失，可能是堿中和了發(fā)酵液中的有機(jī)酸，殘留部分細(xì)菌素起到的抑菌效果。

2.3 篩選菌株的生長(zhǎng)特性

2.3.1 生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力

觀察篩選乳酸菌菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h內(nèi)的生長(zhǎng)趨勢(shì)和產(chǎn)酸能力，結(jié)果見圖2。由圖2可知，4株菌株的生長(zhǎng)曲線均呈“S”型，0～8 h為生長(zhǎng)延滯期，菌體濃度不增長(zhǎng)或增長(zhǎng)緩慢；8～16 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，尤其8～12 h生長(zhǎng)快速，此時(shí)細(xì)胞代謝非常活躍；18 h后生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，OD600nm值穩(wěn)定在2.4左右。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液pH逐漸下降，培養(yǎng)20～24 h，菌株Y1的pH趨于3.5，菌株Y4、Y14、Y15的pH趨于2.5，說明4株菌株發(fā)酵后均能產(chǎn)酸，且菌株Y4、Y14、Y15的產(chǎn)酸能力高于菌株Y1。

圖2 4株篩選菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線Fig.2 Growth and acid production curves of 4 screened strains

2.3.2 抑菌動(dòng)力學(xué)曲線

對(duì)菌株Y1、Y4、Y14、Y15進(jìn)行抑菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，發(fā)酵上清液在培養(yǎng)4 h時(shí)開始具有抑菌活性，在生長(zhǎng)延滯期抑菌活性增加緩慢；在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)，抑菌活性增加較快；進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后抑菌活性基本穩(wěn)定。根據(jù)Gaden的分批發(fā)酵產(chǎn)物動(dòng)力學(xué)學(xué)說[28]，產(chǎn)物生成與菌體生長(zhǎng)相關(guān)，即抑菌曲線和生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)伴隨式生長(zhǎng)，為生長(zhǎng)偶聯(lián)型。

圖3 4株篩選菌株對(duì)大腸桿菌（A）、普通變形桿菌（B）及枯草芽孢桿菌（C）的抑菌動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Antibacterial kinetics curves of 4 screened strains against Escherichia coli (A), Proteus vulgaris (B) and Bacillus subtilis (C)

2.3.3 耐酸堿能力

對(duì)菌株Y1、Y4、Y14、Y15進(jìn)行耐酸堿試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，4株菌株的最適生長(zhǎng)pH值為6.0。菌株Y1在pH 5.0～8.0時(shí)生長(zhǎng)良好，在pH＜5.0和pH＞8.0時(shí)生長(zhǎng)受到抑制。菌株Y4、Y14在pH 5.0～7.0、菌株Y15在pH 4.0～7.0時(shí)生長(zhǎng)良好，菌株Y14和Y15在pH 4.0時(shí)的OD600nm值分別為0.800、1.802，高于菌株Y1（0.231）和Y4（0.190），菌株Y1和Y15在pH 8.0時(shí)的OD600nm值分別為1.387、0.769，高于菌株Y4（0.185）和Y14（0.148），說明菌株Y15、Y14的耐酸能力高于菌株Y1和Y4，菌株Y1、Y15的耐堿能力高于Y4和Y14。綜上，菌株Y15的耐酸較好，菌株Y1的耐堿性較好。

圖4 4株篩選菌株的耐酸堿能力Fig.4 Acid and alkali tolerance of 4 screened strains

2.3.4 耐滲透壓能力

對(duì)菌株Y1、Y4、Y14、Y15進(jìn)行耐滲透壓試驗(yàn)，結(jié)果見圖5。由圖5可知，菌株Y1、Y4、Y15在不添加NaCl時(shí)生長(zhǎng)最好。隨著NaCl含量的增加，菌株的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制。當(dāng)NaCl含量為2%時(shí)，菌株Y14和Y15生長(zhǎng)較好，OD600nm值分別為2.355、2.383；當(dāng)NaCl含量為4%時(shí)，菌株Y14和Y15能生長(zhǎng)，且菌株Y15的OD600nm值（1.430）高于菌株Y14（0.560），而菌株Y1和Y4幾乎不生長(zhǎng)；當(dāng)NaCl含量≥6%時(shí)，所有菌株幾乎不生長(zhǎng)。綜上，菌株Y15的耐滲透壓能力最好。

圖5 4株篩選菌株的耐滲透壓能力Fig.5 Osmotic pressure tolerance of 4 screened strains

2.4 篩選菌株的鑒定

基于16S rDNA基因序列構(gòu)建4株篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖6。由圖6可知，菌株Y1和Y4與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）聚于一支，親緣關(guān)系最近；菌株Y14和Y15與植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）聚于一支，親緣關(guān)系最近。因此，鑒定菌株Y1和Y4為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），鑒定菌株Y14和Y15為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）。

圖6 基于16S rDNA基因序列4株篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 4 screened strains based on 16S rDNA gene sequences

3 結(jié)論

本研究以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）為指示菌，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法結(jié)合牛津杯法從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選得到4株具有良好抑菌活性的乳酸菌菌株，分別為Y1、Y4、Y14和Y15。4株菌株的發(fā)酵上清液均能抑制3種指示菌的生長(zhǎng)，其中，菌株Y1抑菌活性較好，對(duì)3種指示菌的抑菌圈直徑均達(dá)＞13 mm，其發(fā)酵上清液在60 ℃、100 ℃處理后的抑菌活力保持在69%以上；菌株Y1、Y14、Y15發(fā)酵上清液經(jīng)酸堿處理后在調(diào)回抑菌活力仍保持在67%以上。4株菌株的生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酸特性和抑菌活性存在生長(zhǎng)偶聯(lián)相關(guān)性，進(jìn)入穩(wěn)定期后，抑菌圈直徑趨于穩(wěn)定，可在發(fā)酵12～18 h時(shí)終止發(fā)酵。4株菌株均在pH 5.0～7.0時(shí)生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)pH均為6.0，其中菌株Y15耐酸性及耐滲透性較好，菌株Y1耐堿性較好。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，菌株Y1和Y4為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），菌株Y14和Y15為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）。