響應面法優化柘果白蘭地原酒發酵條件

吳雋松，滕飛翔，楊留才*

（江蘇醫藥職業學院 基礎醫學部，江蘇 鹽城 224005）

柘樹又名黃金木，桑科植物，是素有“南檀北柘”之稱的名貴樹種，其樹根和樹皮可入藥[1]。近期研究發現，柘樹的樹根有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、抑制α-葡萄糖苷酶活性[4]和降血壓[5]的作用。柘樹的樹莖被當作原料制作糖漿和顆粒制劑，治療消化道腫瘤。柘樹的樹莖中含有一種黃色的著色劑，是古代皇家龍袍的染料[6]。在很長的一段時間里，柘樹的樹葉一直被制成功能性茶飲，同時也是養蠶行業完美的食物來源[7]。柘果是柘樹的果實，糖類成分含量為1.801～2.402 g/L[11]，含有黃酮[12]、氧化蒽酮[13]、生物堿[14]和有機酸[15]等具有藥用價值的化合物[8-14]。在韓國，柘果的開發利用起步較早，柘果被制成果汁、果醬、果酒和其他保健食品[15]。柘木在我國栽培時間較早但對柘果的開發起步較晚，由于柘果不耐儲存，冷藏條件下可以保鮮一周左右，冷藏溫度較低或者時間較長都會直接影響柘果的品質和口感。因此對柘果的開發利用是一項值得研究的課題。

白蘭地起源于法國，狹義上講，是以葡萄為原料發酵后經蒸餾得到的高度酒，再經橡木桶貯存而成。未經蒸餾的白蘭酒精度較低，經二次蒸餾后成品酒的酒精含量約為40%vol。白蘭地大多是以葡萄為原料，也有一些以其他水果為原料釀造的，這種白蘭地會添加水果的名稱，如藍莓白蘭地、山楂白蘭地等[16]。本試驗以柘果為原料釀造白蘭地，對其發酵條件進行優化，以期為柘果在中國的開發利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柘果：山東省平陰縣東阿鎮鑫合種植農民專業合作社；檸檬酸（食品級）：北京盒子生工科技有限公司；液體果膠酶（酶活力8萬U/mL）：河北潤步生物科技有限公司；白砂糖：市售；葡萄酒活性干酵母SY：安琪酵母股份有限公司；焦亞硫酸鈉（食品級）：陜西源優生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-2 水浴鍋：常州天瑞儀器有限公司；PHSJ-5T pH 計：上海儀電科學儀器有限公司；ZWYRD2403 恒溫培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；UV3000分光光度計：上海精科實業有限公司；WAY-32 糖度折光儀：上海光學儀器五廠有限公司；L18-Y915S破壁機：九陽股份有限公司；CJM-549酒精計（0%vol～100%vol）：衡水創紀儀器儀表有限公司；QP2010氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatographymassspectrometry，GC-MS）：島津（上海）實驗器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柘果白蘭地發酵工藝流程及操作要點

柘果→帶皮破碎→檸檬酸調酸→加果膠酶解→調節糖度→加焦亞硫酸鈉→滅菌→加酵母菌粉→發酵→一次蒸餾→二次蒸餾→加入中度烘焙橡木片→過濾→柘果白蘭地

原料處理：挑選表皮無破損、無腐爛的完整柘果，自來水流動沖洗后晾干。

破碎：使用破壁機破碎20 s，粒度為60目。

調節酸度：使用檸檬酸調節pH至3.5。

酶解：將柘果汁與純凈水按1∶1.5（V/V）的比例混合，加入0.1%果膠酶，在50 ℃條件下酶解2 h。

調節糖度：加入白砂糖將初始糖度調整為24°Bx。

滅菌：加入0.01%焦亞硫酸鈉，滅菌2 h。

酵母菌接種：按照1 L果汁加2 g果酒釀造專用酵母菌粉的比例接種酵母，使用前用30 ℃無菌水將酵母粉活化30 min。

發酵：發酵容器上安裝s型單向排氣閥，排氣閥中加入少量無菌水（發酵過程中注意及時添加無菌水，使容器一直處于密閉狀態），既能使發酵容器密閉，又能達到將發酵過程中的氣體排出的目的。將發酵容器置于28 ℃恒溫恒濕培養箱中發酵9 d，期間定時攪拌。

蒸餾：采用蒸餾裝置進行一次蒸餾和二次蒸餾。一次蒸餾時溫度80 ℃，流出酒酒精度降低至5%vol時停止接酒；二次蒸餾時溫度65 ℃，流出酒酒精度降低至5%vol時停止接酒，并去掉酒頭和酒尾。

添加橡木片：按照1 L白蘭地添加5 g中度烘焙橡木片的比例添加橡木片，浸泡4周。

過濾：用三層紗布進行過濾，即得柘果白蘭地。

1.3.2 柘果果酒發酵條件優化單因素試驗

初始糖度：在發酵時間為7 d、發酵溫度為28 ℃、酵母菌添加量為0.2%的條件下，分別考察不同初始糖度（16°Bx、20°Bx、24°Bx、28°Bx、32°Bx）對柘果白蘭地感官評分的影響。

發酵時間：在發酵溫度為28 ℃、酵母菌添加量為0.2%、初始糖度為24°Bx的條件下，分別考察不同發酵時間（7 d、8 d、9 d、10 d、11 d）對柘果白蘭地感官評分的影響。

酵母菌添加量：在發酵時間為7 d、發酵溫度為28 ℃、初始糖度為24°Bx 的條件下，分別考察不同酵母菌添加量（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）對柘果白蘭地感官評分的影響。

1.3.3 柘果果酒發酵條件優化響應面試驗

基于單因素試驗結果，以初始糖度（A）、發酵時間（B）和酵母菌添加量（C）為考察因素，使用Design-Expert 8.0.6.1軟件，以柘果白蘭地感官評分（R）為響應值，設計3因素3水平響應面試驗優化柘果果酒發酵條件，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 柘果果酒發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation process optimization of Cudrania tricuspidata wine

表2 柘果白蘭地感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of Cudrania tricuspidata brandy

1.3.4 測定方法

感官評定：由15名釀造專業的評審員組成評價小組，以GB/T 11856—2008《白蘭地》的感官要求為感官評價參考標準，從外觀、香氣、口感和風格四個方面對樣品進行打分，滿分為100分，取15人的平均分。

總酸、總糖含量：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的檢測方法測定[17]；甲醇含量采用GB 5009.266—2016 食品安全國家標準《食品中甲醇的測定》中的檢測方法測定[18]；乙醇含量采用GB 5009.225—2016 食品安全國家標準《酒中乙醇濃度的測定》中的檢測方法測定[19]；總酯含量采用GB/T 11856—2008《白蘭地》中的方法[20]。

揮發性風味物質采用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法測定[19]。

（1）樣品前處理：準確取3 mL樣品置于30 mL固相微萃取采樣瓶中，加入1 μL質量濃度為10 μL/mL乙酸戊酯為內標，加入3.0 mL去離子水和0.3 g NaCl，放入磁力轉子，密封后將樣品瓶置于65 ℃水浴中熱平衡10 min，磁力攪拌器速度設置為800 r/min，用正己烷清洗萃取針頭表面并對其進行活化，將活化后的萃取針頭插入樣品瓶內，推出纖維頭，使之距樣品液面約8 mm，頂空萃取50 min。萃取完畢迅速取出萃取針頭，并將萃取針頭迅速插入氣相色譜質譜聯用儀的進樣口中熱解吸6 min，進樣。

（2）氣相色譜條件：固相微萃取針頭型號為75 μm CAR/PDMS。采用Agilent HP-5毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為高純He（99.999%），流速1 mL/min，不分流進樣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保留10 min；以5 ℃/min升至90 ℃，保留5 min；再以2 ℃/min升至180 ℃，保留5 min；最后以20 ℃/min升至280 ℃。

（3）質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍25～450 amu；輔助溫度280 ℃；掃描模式Scan。

（4）定性定量方法：檢測出的物質根據相似度和保留指數，通過美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）20譜庫結合人工解譜的方法進行定性（匹配度＞80%）。采用內標法對檢測物進行定量分析。

1.3.5 數據處理

采用SPSS 22.0 軟件進行顯著性分析，P＜0.01，表示差異性極顯著，P＜0.05，表示差異性顯著，結果以“平均值±標準差”表示。采用Design Expert 8.0.6 軟件對數據進行分析處理，采用Origin 8.5 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 柘果果酒發酵條件優化單因素試驗結果

根據白蘭地的釀造工藝，將發酵結束后的果酒進行二次蒸餾，得到的白蘭地酒精度為40%vol，進行后續的檢測以及感官評分。

2.1.1 初始糖度對柘果白蘭地品質的影響

由圖1可以看出，隨著初始糖度的增加，總酸含量呈現下降的趨勢，總糖含量呈現上升趨勢，揮發性風味物質含量、感官評分呈現先上升后下降的趨勢，甲醇含量呈先下降后上升再下降的趨勢；初始糖度為24°Bx時，揮發性風味物質含量最高為（1.24±0.07）g/L；糖度過低時酵母菌代謝不足，糖度過高時會抑制酵母的代謝活性，都不利于揮發性風味物質的產生[21]。此時甲醇含量最低為（107±5.07）mg/L，酵母代謝途徑分為糖代謝途徑和其他物質代謝途徑，當初始糖度過高或者過低都會引發酵母進行其他物質代謝途徑，從而導致甲醇含量升高[16，22]。初始糖度為28°Bx時，感官評分值最高為（85.97±0.71）分。綜合考慮，選取初始糖度20°Bx、24°Bx、28°Bx為響應面優化試驗的3個水平。

圖1 初始糖度對柘果白蘭地品質的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on the quality of Cudrania tricuspidata brandy

2.1.2 發酵時間對柘果白蘭地品質的影響

由圖2可以看出，隨著發酵時間的延長，總酸含量呈現上升的趨勢[23]，總糖含量呈現下降的趨勢，揮發性風味物質含量、感官評分呈現先上升后下降的趨勢，甲醇含量變化不明顯；發酵時間為9 d時，揮發性風味物質含量達到最高，為（1.21±0.04）g/L，這種現象可能是由于風味物質的自然揮發或者被酵母代謝消耗[24-25]；發酵時間為9 d時，感官評分為（86.11±0.67）分，發酵時間為10 d時，感官評分最高為（86.25±0.49）分。綜合考慮，選取發酵時間8 d、9 d、10 d為響應面優化試驗的3個水平。

圖2 發酵時間對柘果白蘭地品質的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the quality of Cudrania tricuspidata brandy

2.1.3 酵母添加量對柘果白蘭地發酵品質的影響

由圖3可以看出，隨著酵母添加量的增加，總酸含量呈現升高的趨勢[26]，總糖含量呈現下降的趨勢，揮發性風味物質含量變化不大，甲醇含量呈現先下降后上升的趨勢，感官評分呈現先上升后下降的趨勢；酵母添加量為0.10%時，甲醇含量最低為（113.67±1.53）mg/L；酵母添加量為0.20%時，感官評分值最高為（84.26±0.35）分。綜合考慮，選取酵母添加量0.15%、0.20%、0.25%為響應面優化試驗的3個水平。

圖3 酵母菌添加量對柘果白蘭地品質的影響Fig.3 Effect of yeast addition on the quality of Cudrania tricuspidata brandy

2.2 柘果果酒發酵條件優化響應面試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以初始糖度（A）、發酵時間（B）及酵母添加量（C）為3個因素，以柘果白蘭地感官評分（R）為響應值，采用Design Expert 13軟件設計Box-Behnken試驗，對柘果果酒發酵條件進行優化。響應面試驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

表3 柘果果酒發酵條件優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation process optimization of Cudrania tricuspidata wine

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

根據表3數據得到柘果白蘭地感官評分響應值所得回歸方程：

由表4可知，試驗所預設的各種因素對感官評分的影響各不相同，按F值排列順序為B＞A＞C，即對感官評分的影響為發酵時間＞初始糖度＞酵母添加量。由P值可知，交互項AC、BC對感官評分的影響顯著（P＜0.05），一次項A、B、C，交互項AB，二次項A2、B2、C2對感官評分的影響極顯著（P＜0.01）。失擬項P值不顯著（P＞0.05），說明回歸方程擬合度良好，能較好的在變量范圍內反映響應值的變化情況，可以用于柘果白蘭地發酵工藝的預測。

各因素交互作用對柘果白蘭地感官評分影響的響應面及等高線如圖4所示。由圖4可知，初始糖度（A）、發酵時間（B）和酵母接種量（C）這3個因素交互作用在感官評分響應面3D圖上均存在極值，AB交互作用的響應面坡度趨勢陡峭，說明AB交互作用對感官評分的影響較大，與方差分析結果一致。

圖4 各因素交互作用對柘果白蘭地感官評分影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation score of Cudrania tricuspidata brandy

預測柘果白蘭地最佳發酵工藝參數為初始糖度26.59°Bx，發酵時間9.61 d，酵母添加量0.21%。在此條件下，感官評分預測值為87.99分。為方便實際操作，修改發酵條件為初始糖度26.6 °Bx，發酵時間10 d，酵母添加量0.2%，在此條件下進行3次平行驗證試驗，最終得到感官評分實際值為86.59分，與預測值接近，證明該模型可行。

2.3 柘果白蘭地品質指標

在最佳條件下發酵得到的柘果白蘭地成品感官評分為86.59分，外觀呈金黃色，澄清透亮，無沉淀物，香氣協調且平衡，酒體醇厚飽滿，細膩綿柔，無辛辣味，具有柘果白蘭地的特殊風格。酒精度為40%vol、總酸含量為2.05 g/L、總酯含量為2.96 g/L、總糖含量為3.03 g/L、甲醇含量為121 mg/L（≤2.0 g/L）、揮發性風味物質含量為1.22 g/L，理化指標符合GB/T 11856—2008《白蘭地》的要求。細菌總數≤50CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/mL，沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌檢出。

3 結論

通過單因素試驗研究初始糖度、發酵時間和酵母接種量對柘果白蘭地品質的影響，進一步利用Box-Behnken響應面試驗優化發酵條件。結果表明，最佳發酵條件為初始糖度26.6°Bx，發酵時間9.6 d，酵母添加量0.2%。在此發酵條件下得到的柘果果酒經蒸餾得到的柘果白蘭地，外觀呈金黃色，澄清透亮，無沉淀物，香氣協調且平衡，酒體醇厚飽滿，細膩綿柔，無辛辣味，具有柘果白蘭地的特殊風格，感官評分為86.59分。酒精度為40%vol、總酸含量為2.05 g/L、總酯含量為2.96 g/L、總糖含量為3.03 g/L、甲醇含量為121 mg/L（≤2.0 g/L）、揮發性風味物質含量為1.22 g/L，品質指標符合GB/T 11856—2008《白蘭地》的要求。