自體富血小板血漿通過Notch1調節骨質疏松大鼠骨折愈合

沈靈杰 秦超 劉合飛

南通市海門區人民醫院手足外科,江蘇 南通 226100

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)患者的骨骼脆弱,具有較高的骨折風險[1]。OP性骨折患者的生活質量降低、病死率較高,給家庭及醫療保健系統帶來了沉重負擔[2]。開發新的治療方法來加快OP骨折患者骨組織修復及愈合,是骨科研究的重要任務之一。

富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)是一種超生理濃度的血小板濃縮物,可通過釋放多種高濃度的生長因子、轉化生長因子,來促進創傷區快速止血、栓塞血管再通,炎癥反應快速應答、肉芽組織修復生長[3-4]。近來研究發現,PRP也可為骨折愈合提供富含生長因子及衍生蛋白的有利微環境,來加速成骨細胞、破骨細胞的增殖和遷移,并快速有效的促進骨折修復與重建,而受到骨科研究的重視[5]。但PRP加速骨質生長、促進骨折愈合的具體分子生物學機制還不甚明確。

Notch通路可調控骨形成蛋白(BMP)表達,抑制成骨細胞、骨原細胞分化等來參與OP性骨折愈合過程,而逐漸受到骨科研究學者的重視[6]。PRP能否調控Notch活化,來發揮促骨質生長及骨愈合作用,還未見報道。本研究擬建立大鼠OP性骨折模型,制備自體PRP并進行干預,從Notch通路方面探究PRP促OP性骨折愈合的可能機制,以期為PRP的開發應用及在OP方面的治療提供可靠資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物:SPF級SD雄性大鼠60只,6～8月齡,體重250～300 g,購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司,生產許可證號為SCXK(京)2020-0007;所有大鼠于動物實驗中心房中常規飼養。本試驗動物符合3R原則,試驗經南通市海門區人民醫院倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑及儀器:維甲酸(貨號:1674004,上海玉博生物科技有限公司);Notch通路抑制劑(γ-分泌酶抑制劑,DAPT)(貨號:M00762,北京百奧萊博科技有限公司);骨鈣素(OCN)ELISA試劑盒(貨號:YK-08750,北京伊塔生物科技有限公司)、骨性堿性磷酸酶(BAP)ELISA試劑盒(貨號:RX301001R,泉州市睿信生物科技有限公司)、血小板源生長因子(PDGF)ELISA試劑盒(貨號:F16541,上海西唐生物科技有限公司)、轉化生長因子-β(TGF-β)ELISA試劑盒(貨號:SND-R746,滁州仕諾達生物科技有限公司)、胰島素樣生長因子1受體(GF-1R)ELISA試劑盒(貨號:CD-108844,武漢純度生物科技有限公司);堿性磷酸酶鈣-鈷法染色試劑盒(貨號:YM-S1519,上海遠慕生物科技公司);抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(貨號:SY6328,北京伊塔生物科技有限公司);兔抗大鼠Notch1、骨形態發生蛋白(BMP)、骨保護素(OPG)、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)等抗體(美國abcam公司,貨號:ab184742、ab214821、ab203061、ab62516);SkyScan1276小動物顯微CT(Micro-CT)影像系統購自布魯克(北京)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠OP性骨折模型建立及分組給藥:取SD雄性大鼠,參照文獻[7]灌胃給予70 mg/kg維甲酸,1次/d,14 d后用小動物顯微CT(Micro-CT)檢測骨密度。確認為OP后,將大鼠麻醉,用右側股骨干骨折髓內固定術建立OP性骨折模型,并分為模型組、PRP組、DAPT組(Notch通路抑制劑DAPT)、PRP+DAPT組,每組12只,另取12只正常雄性大鼠,用閉合骨折制備法造成大鼠右側股骨中段骨折,設為正常骨折組,來作為對照。PRP組參照文獻[8]在大鼠造模前,經眼眶采血3 mL制備PRP凝膠溶液[(血小板平均濃度為(12.05±0.29)×1012/L、白細胞平均濃度為(3.81±0.26)×109/L],取PRP凝膠溶液注射至骨折斷之間,1次/d;DAPT組尾靜脈注射1 mg/kg的DAPT溶液[9],1次/d;PRP+DAPT組給予PRP凝膠溶液的同時,尾靜脈注射給予DAPT溶液;模型組及正常骨折組于骨折斷端注射給予不含PRP的凝膠溶液0.3 mL。各組連續給藥6周,末次給藥結束后12 h,取大鼠進行后續試驗。

1.2.2X線觀察大鼠骨折愈合情況:各組大鼠末次給藥結束后,用X線檢測骨折愈合情況,骨折愈合評價采用盲法進行,由不知實驗分組的本院骨科醫師完成。

1.2.3ELISA法測大鼠血清OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R水平變化:將大鼠麻醉,取腹主動脈血,按ELISA試劑盒說明書方法檢測血清OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R水平。

1.2.4Micro-CT法檢骨痂組織結構變化:處死大鼠6只,取右側股骨組織,按照文獻[7]方法對大鼠股骨進行Micro-CT掃描,并計算骨小梁數量、骨小梁厚度、骨體積/總體積、骨密度等指標變化。取骨痂組織進行螯合劑乙烯二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、透明、石蠟包埋后,切成厚度為5 μm切片,備用。

1.2.5堿性磷酸酶鈣-鈷法染色及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法分別檢測成骨細胞及破骨細胞數目:取1.2.4項下的骨痂組織切片,按分別按堿性磷酸酶鈣-鈷及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒說明書方法染色、孵育、封片后,置于顯微鏡下觀察拍照,用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統計算單位面積內陽性染色的細胞數目。

1.2.6免疫組化染色法檢測骨痂組織Notch1陽性表達水平:取1.2.4項下的剩余骨痂石蠟切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,微波法修復抗原后,3%過氧化氫孵育10 min,并用10%山羊血清封閉10 min;加入一抗(Notch1,1∶500)4 ℃孵育過夜,洗去一抗,加入羊抗兔二抗(1∶800)室溫孵育1.5 h,DAB顯色、蘇木精復染封片后,于光鏡下觀察Notch1陽性表達(細胞呈棕黃色)并拍照,用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統分析單位面積內陽性染色區域的積分光密度值。每張切片隨機選取5個視野,取均值。

1.2.7Western Blot法測骨痂組織BMP、OPG、RANKL蛋白表達水平:將剩余大鼠處死,取骨痂組織,液氮中凍存后,研磨、加勻漿液勻漿后提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度,取20 μg蛋白上樣、電泳、轉膜反應后,加入一抗BMP、OPG、RANKL(1∶800)、β-actin(1∶500)4 ℃孵育過夜,加入羊抗兔二抗(1∶800)37 ℃孵育2.5 h后,增強化學發光法顯色,以凝膠成像儀觀察條帶并拍照,并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 PRP對OP性骨折大鼠骨折愈合變化的影響

正常骨折組大鼠骨折線模糊不清,骨折斷端骨痂形成明顯,骨折愈合較好。模型組及PRP+DAPT組大鼠骨折線清晰,有少量骨痂形成,但未連接,骨折愈合不佳。與模型組相比,PRP組大鼠骨折線模糊或消失,骨折斷端有大量骨痂形成,且骨痂在骨折斷端呈連續性包繞貫穿,骨折處髓腔再通。DAPT組大鼠骨折線清晰,骨折斷端幾乎未見骨痂形成,骨折愈合欠佳,見圖1。

圖1 各組大鼠骨折部位X線掃描圖Fig.1 X-ray scan of fracture site of rats in each group

2.2 PRP對OP性骨折大鼠股骨骨密度、骨痂體積/總體積、骨小梁數量、骨小梁分離度的影響

與正常骨折組相比,模型組大鼠骨密度、骨痂體積/總體積、骨小梁數量、骨小梁厚度均降低(P<0.05)。與模型組相比,PRP組大鼠骨密度、骨痂體積/總體積、骨小梁數量、骨小梁厚度均升高(P<0.05);DAPT組大鼠骨密度、骨痂體積/總體積、骨小梁數量、骨小梁厚度進一步降低(P<0.05)。PRP+DAPT組大鼠上述指標變化與PRP組相反(P<0.05),見圖2、表1。

表1 各組大鼠股骨骨密度、骨體積/總體積、骨小梁數量、骨小梁厚度比較

圖2 Micro-CT檢測各組大鼠骨微結構變化Fig.2 Micro-CT detected the changes of bone microstructure in each group

2.3 PRP對OP性骨折大鼠骨痂組織成骨細胞數目及破骨細胞數目表達的影響

堿性磷酸酶鈣-鈷法染色顯示,成骨細胞胞核呈圓形,細胞質染色呈黑色,其表面有細小凸起,主要靠近骨小梁邊緣,緊密排列成立方體或矮柱狀,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色顯示,破骨細胞呈紅色或暗紅色,由多核巨細胞組成,分布于骨髓腔邊緣。與正常骨折組相比,模型組大鼠成骨細胞數目降低(P<0.05),破骨細胞數目升高(P<0.05)。與模型組相比,PRP組大鼠成骨細胞數目升高(P<0.05),破骨細胞數目降低(P<0.05)。DAPT組大鼠成骨細胞數目進一步降低(P<0.05),破骨細胞數目進一步升高(P<0.05)。PRP+DAPT組大鼠上述指標變化與PRP組相反(P<0.05),見圖3、表2。

表2 各組大鼠骨痂組織成骨細胞數目及破骨細胞數目比較個/mm2)

圖3 各組大鼠骨痂組織成骨細胞(堿性磷酸酶鈣-鈷法染色,400×)及破骨細胞(抗酒石酸酸性磷酸酶法染色,200×)比較Fig.3 Osteoblasts (Calcium Cobalt alkaline phosphatase staining, 400×) and osteoclasts (tartrate-resistant acid phosphatase staining, 200×) were compared in each group

2.4 PRP對OP性骨折大鼠骨痂組織中Notch1陽性表達的影響

免疫組化顯示Notch1在正常骨折組大鼠骨痂組織中呈強陽性表達。與正常骨折組相比,模型組大鼠Notch1陽性表達降低[(6.19±0.64)平均光密度/mm2比(21.13±2.11)平均光密度/mm2,P<0.05]。與模型組相比,PRP組大鼠Notch1陽性表達升高[(20.71±0.69)平均光密度/mm2比(6.19±0.64)平均光密度/mm2,P<0.05]。DAPT組大鼠Notch1陽性表達進一步降低[(1.11±0.22)平均光密度/mm2比(6.19±0.64)平均光密度/mm2,P<0.05]。與PRP組相比,PRP+DAPT組大鼠Notch1陽性表達降低[(6.28±0.61)平均光密度/mm2比(20.71±0.69)平均光密度/mm2,P<0.05],見圖4。

圖4 大鼠骨痂組織Notch1免疫組化染色圖(400×)Fig.4 Notch1 immunohistochemical staining of rat callus tissue (400×)

2.5 PRP對OP性骨折大鼠血清OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R水平的影響

與正常骨折組相比,模型組大鼠血清OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R等水平降低(P<0.05)。與模型組相比,PRP組大鼠OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R等水平升高(P<0.05)。DAPT組大鼠OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R等水平進一步降低(P<0.05)。PRP+DAPT組大鼠上述指標變化與PRP組相反(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠血清OCN、BAP、PDGF、TGF-β、IGF-1R水平比較Table 3 Comparison of serum levels of OCN, BAP, PDGF, TGF-β and IGF-1R in each group

2.6 PRP對OP性骨折大鼠骨痂組織BMP、OPG、RANKL蛋白表達的影響

與正常骨折組相比,模型組大鼠骨痂組織BMP、OPG蛋白表達降低(P<0.05),RANKL蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組相比,PRP組大鼠骨痂組織BMP、OPG蛋白表達升高(P<0.05),RANKL蛋白表達降低(P<0.05)。DAPT組大鼠骨痂組織BMP、OPG蛋白表達進一步降低(P<0.05),RANKL蛋白表達進一步升高(P<0.05)。PRP+DAPT組大鼠上述指標變化與PRP組相反(P<0.05),見圖5、表4。

表4 各組大鼠骨痂組織BMP、OPG、RANKL蛋白表達比較Table 4 Comparison of BMP, OPG and RANKL protein expression in callus tissue of rats in each group

圖5 各組大鼠骨痂組織BMP、OPG、RANKL蛋白表達免疫印跡圖Fig.5 Western Blot of BMP, OPG and RANKL protein expression in callus tissue of rats in each group

3 討論

OP患者骨量減少、骨結構異常、骨脆性增加,是導致骨折發生率升高的重要原因之一[10]。維甲酸又叫維A酸,可影響骨的正常生長、發育及代謝,引起OP形成[11]。本研究用維甲酸誘導建立大鼠模型后發現,大鼠股骨骨密度降低,預示大鼠OP模型建立成功。本研究結果顯示,與正常骨折組相比,OP性大鼠骨折線清晰、骨痂體積減少、骨小梁密度及厚度降低、骨細胞指數降低、骨愈合時間延長,與骨形成有關的血清骨鈣素、骨性堿性磷酸酶(BAP)含量明顯減少,提示OP性骨折組大鼠出現骨密度降低、骨痂形成減少及骨愈合延遲的現象,表明造模成功。

骨折時,骨折斷端聚集的大量血小板,可釋放大量的PDGF、TGF-β、IGF等來促進成骨增殖、調節骨細胞功能和代謝等,而參與骨修復與再生過程[12-13]。PRP中含有大量的PDGF、TGF-β、IGF等生長因子,且自體提取制備的PRP,具有制備簡單、可行性高、價格低廉、生物安全性高及并發癥少等優點,被證實具有加速骨細胞活化、促進骨缺損修復、骨誘導再生等作用,而在骨折治療中有廣闊的應用前景[14-15]。冀少林等[8]建立大鼠OP性骨折模型,證實PRP可促進OP性骨折大鼠骨痂形成。本研究發現,PRP組大鼠干預治療后,大鼠血清中DGF、TGF-β、IGF水平異常升高,骨痂體積、骨小梁形成及骨愈合水平均高于OP性骨折模型組,證實PRP具有較好的促進OP性骨折愈合作用。但其具體分子生物學機制還有待進一步驗證。

Notch信號通路是骨代謝過程中的重要通路[16]。大量文獻研究發現,當Notch信號出現異常時,會引起骨發育失調、骨質疏松、骨軟化等[17]。周靈通等[18]發現,Notch可表達于成骨細胞中,可通過抑制破骨細胞分化和成熟來促進骨礦物質沉積。Ballhause等[19]發現,Notch活化可通過促進BMP、OPG等促成骨活化因子表達,抑制破骨細胞活化來影響骨代謝及骨重建過程。本研究發現,OP性骨折組大鼠骨密度降低、骨愈合延遲的同時,骨痂組織中Notch1表達顯著降低,BMP、OPG等促成骨活化因子表達降低,RANKL等骨吸收反應相關因子表達增加,進一步抑制大鼠Notch1表達,大鼠骨密度進一步降低,骨折愈合更加緩慢。本研究發現,PRP促進大鼠骨密度升高、加快骨折愈合的同時,Notch1及BMP、OPG表達也升高,提示PRP促進OP性骨折大鼠骨量增加及骨折愈合的作用,也可能與促進Notch1通路激活有關。Notch通路抑制劑-DAPT可逆轉PRP的上述作用。

綜上所述,PRP促進OP性骨折大鼠骨量增加及骨折愈合的作用,也可能與促進Notch1通路激活有關。這可能為闡明PRP改善OP性骨折的分子生物學機制,提供一定參考。但OP性骨折骨密度降低及骨折愈合的調控機制復雜,涉及多條通路多個細胞因子共同調節,Notch可能只是其中的一條途徑。PRP促進OP性骨折愈合的其他分子機制,仍需繼續深入研究。