注射用奈達鉑的血管刺激性、溶血性和過敏性試驗研究

余 慶，楊文祥*，吳 琳

（1.應用毒理湖北省重點實驗室，湖北武漢 430079；2.湖北省疾病預防控制中心，湖北武漢 430079）

0 引言

奈達鉑又名順式-乙醇酸-二氨合鉑，是一種廣譜的抗腫瘤藥。奈達鉑適用于頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食管癌、膀胱癌、睪丸腫瘤、卵巢癌、宮頸癌等。奈達鉑在臨床上作為第三代鉑類抗腫瘤藥，具有水溶性好、毒副作用較小等優勢，常用于臨床抗腫瘤化療[1-4]。本試驗按照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》[5]的要求，對仿制藥注射用奈達鉑的安全性進行了評價，為臨床安全用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

受試制劑：注射用奈達鉑（規格：50 mg/支，批號：202104S1，某藥業股份有限公司）；參比制劑：注射用奈達鉑（Aqulpa）（規格：50 mg/支，批號：HT0100，吉林恒金藥業股份有限公司）；溶媒：0.9%氯化鈉注射液（規格：100 ml：0.9 g，批號：210507521，武漢福星生物藥業有限公司）；雞蛋清白蛋白（規格：25 g/瓶，批號：KA0418BY14，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 實驗動物

Hartley豚鼠，普通級，雌雄各半，體重范圍303～387 g，由湖北逸摯誠生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2021-0020。日本大耳白兔，普通級，雌雄各半，體重范圍2.1～2.7 kg，由湖北逸摯誠生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號為：SCXK（鄂）2021-0020。

1.3 飼養管理條件

豚鼠飼養于本單位普通級豚鼠實驗室，實驗動物使用許可證號為：SYXK（鄂）2017-0065。日本大耳白兔飼養于本單位普通級家兔實驗室，實驗動物使用許可證號為：SYXK（鄂）2017-0065。豚鼠和日本大耳白兔實驗室相對濕度控制范圍均在40%～70%，溫度控制范圍在18℃～28℃。飼養室每h換氣次數8次以上，12 h明/12 h暗循環交替至動物飼養結束。每天喂全價顆粒飼料（武漢市萬千佳興生物科技有限公司），自由飲用自來水。

1.4 耳緣靜脈血管刺激性試驗

選取日本大耳白兔1 2 只，隨機分為受試低劑量組、高劑量組，參比制劑組，每組4只，雌雄各半。注射用奈達鉑推薦的臨床給藥劑量最大值為100 mg/m2，成人體重按70 kg計算，按體表面積公式lgS=0.8762+0.698 lgW[6]，受試制劑低劑量換算成日本大耳白兔給藥劑量為2.6 mg/kg，臨床最大給藥濃度約為0.61 mg/ml，受試制劑高劑量組按照2倍臨床給藥濃度給藥，即1.22 mg/ml，給藥劑量為5.2 mg/kg。參比制劑組給予注射用奈達鉑（Aqulpa）溶液，劑量同受試制劑低劑量組。采用自身對照，右耳緣靜脈注射注射用奈達鉑溶液，給藥容積為4.3 ml/kg，左耳緣靜脈注射等容積0.9%氯化鈉注射液，靜脈注射速度為20滴/min，給藥1次。給藥前、給藥時、給藥后1～2 h和24 h、48 h、72 h、96 h分別對動物和注射部位進行肉眼觀察。給藥后96 h每組安樂死2只日本大耳白兔，雌雄各1只，剪取雙側兔耳，用4%甲醛溶液固定后，剪取耳緣靜脈進針點即A點，進針點靠近近心端方向約3.5 cm處，即B點，進行組織病理學檢查，余下動物繼續觀察到14天，剪取雙側兔耳作病理檢查，觀察注射部位兔耳緣靜脈血管擴張充血、血栓形成、水腫及炎性細胞浸潤等改變[6]。

1.5 體外溶血試驗

日本大耳白兔紅細胞制備：取20 ml日本大耳白兔心臟血，放入含玻璃珠的三角燒瓶中振搖10 min，制備成脫纖血液。隨后加入約10倍量的0.9%氯化鈉注射液搖勻，1 500 r/min離心15 min，除去上清液，再用0.9%氯化鈉注射液洗滌4次沉淀的紅細胞，至上清液不顯紅色終止洗滌，取紅細胞1 ml加入49 ml0.9%氯化鈉注射液，配成2%紅細胞懸液。操作步驟：取12支試管進行編號，1～5號管為受試制劑管，6～10號管為參比制劑管，11號管為陰性對照管，12號管為陽性對照管。按照表1依次加入2%紅細胞懸液、0.9%氯化鈉注射液或蒸餾水，混勻后立即放置在37℃±0.5℃的恒溫箱中進行溫育，開始每隔15 min觀察1次；1 h后，每隔1 h觀察1次，觀察3 h。

表1 注射用奈達鉑體外溶血試驗各個試管各溶液的加入量

結果判定標準：溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留，可判定為全溶血；紅細胞全部下沉，上清液體無色澄明，可判定為無溶血。雖不溶血，但出現棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振蕩后不分散，或顯微鏡下觀察凝聚紅細胞不能被生理鹽水沖散，可判定為凝聚[7]。

1.6 豚鼠主動全身過敏試驗

普通級豚鼠40只，隨機分成5組，每組8只，雌雄各半，即受試制劑低劑量組（給藥濃度為0.61 mg/ml）和高劑量組（給藥濃度為1.22 mg/ml）、參比制劑組（劑量同受試制劑低劑量組）、陰性對照組（0.9%氯化鈉注射液）和陽性對照組（雞蛋清白蛋白）。隔日腹腔注射致敏，共3次，致敏給藥量0.5 ml/只，陽性對照組為0.5 mg/只。末次致敏后14天，每組雌雄各取前2只經靜脈注射進行激發，激發給藥量為1.0 ml/只，陽性對照組為1.0 mg/只。末次致敏后21天，剩余動物，再激發。

觀察各組動物靜脈注射后30 min內的反應及相關癥狀出現和消失的時間，最長觀察3 h，致敏期間每日觀察動物的癥狀，首末次致敏和激發當日測定動物體質量。按全身致敏性評價標準進行評價（見表2），并計算過敏反應發生率。若表現出陽性反應癥狀，可另取健康未致敏豚鼠2只，注射相同溶液，觀察是否出現相同癥狀，綜合考慮進行評價[8]。

表2 過敏反應癥狀及評價標準

2 試驗結果

2.1 耳靜脈血管刺激性試驗

整個試驗過程中，各組試驗動物未見明顯異常；受試制劑組和參比制劑組兔左耳、右耳給藥前，給藥時及給藥后的各個觀察點均未觀察到明顯的耳緣靜脈充血、耳緣紅腫等反應。觀察14天后也未見明顯異常反應。組織病理學檢查結果顯示，注射給藥后96 h處死，在針頭經過的試驗兔耳靜脈的A點主要表現出輕度到中度的血管擴張淤血、少量血栓形成等病理變化；而在注射針頭未到達的B點，受試制劑高劑量組3只和參比制劑組2只動物主要表現為血管輕度擴張淤血，其他試驗兔靜脈未觀察到明顯異常，表明受試制劑注射用奈達鉑未表現出明顯刺激性反應。注射后觀察14天，在針頭經過的試驗兔耳靜脈的A點主要表現為輕度的血管擴張淤血、少量血栓形成；而在注射針頭未到達的部位B點，受試制劑高劑量組1只日本大耳白兔可見血管中度擴張淤血，其他試驗兔耳靜脈未表現出明顯異常，表明受試制劑注射用奈達鉑無明顯血管刺激性反應。

2.2 體外溶血試驗

受制試劑、參比制劑及陰性對照管在各時間點均無溶血，無紅細胞凝聚發生；陽性對照管15 min時出現溶血。表明受試制劑注射用奈達鉑體外溶血試驗對日本大耳白兔紅細胞未見溶血和紅細胞凝集現象。

2.3 豚鼠主動全身過敏試驗

各組動物體重及凈增重比較，采用單因素方差分析，結果顯示，各組雌雄豚鼠體質量均呈增長趨勢，統計學分析無顯著性差異（P＞0.05）。

受試制劑、參比制劑及陰性對照組均未見過敏反應癥狀，致敏率為0。雞蛋清白蛋白陽性對照組，激發后8只動物，產生過敏反應，全部死亡，致敏率達100%。表明受試制劑注射用奈達鉑未引起豚鼠主動全身過敏反應。

3 結論

奈達鉑是一種第二代鉑衍生物，其腎臟和胃腸道毒性比順鉑低。在臨床上，奈達鉑導致的過敏反應主要發生在用藥24 h內，主要累及血液系統，臨床上主要表現為白細胞、中性粒細胞、血小板和血紅蛋白減少，其中血小板減少最常見。近年來，臨床上有過敏性休克發生的報道。其他常見的不良反應包括骨髓抑制、惡心、嘔吐、食欲減退等[9-10]。惡性腫瘤患者化療后常表現出骨髓抑制的不良反應，骨髓抑制的發生風險會隨著藥物的積累而增加，因而奈達鉑骨髓抑制的不良反應具有劑量限制性毒性的特點[11-12]。

本次研究結果表明，注射用奈達鉑在日本大耳白兔血管刺激性試驗中未觀察到明顯刺激性反應，體外溶血試驗結果為陰性，豚鼠主動全身過敏試驗未見陽性反應。本研究中，注射用奈達鉑無血管刺激性、溶血作用以及過敏性，表現出較好的安全性，但臨床上有過敏、消化道刺激等不良反應的報道且骨髓抑制為劑量限制性毒性，提示動物試驗的結果直接應用到人類過程的具有不確定性，需要我們在動物模型和研究方法等方面進行不斷的改進和完善，進而提高動物實驗結果應用到臨床時的準確性。