外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆種子萌發(fā)和幼苗抗氧化酶活性的影響

王志科, 關(guān)偉龍, 李志偉, 孫于卜

(隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/甘肅省隴東生物資源保護(hù)利用與生態(tài)修復(fù)重點實驗室,甘肅 慶陽 745000)

中國鹽堿地總面積達(dá)9.913×107hm2,主要分布在西北、華北、東北、濱海新區(qū)及長江中上游[1]。鹽堿化導(dǎo)致植物體代謝受到影響,同時促進(jìn)毒害物質(zhì)積累、葉綠體分解、植物光合作用能力下降、有關(guān)酶活性降低致使有機(jī)物合成速率降低,從而影響植物體的正常發(fā)育,造成植株生長纖弱、滯育,阻礙了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展[2]。研究結(jié)果表明,高鹽濃度的土壤會抑制植物種子的萌發(fā)[3],因此如何預(yù)防土壤鹽堿化、科學(xué)治理鹽堿地以及對已被鹽堿侵蝕的土壤進(jìn)行修復(fù),成為當(dāng)前國內(nèi)外研究熱點。

利用外源物質(zhì)刺激植物體產(chǎn)生抗逆性反應(yīng)來提高植物抵抗外界脅迫是有效路徑之一。過氧化氫( Hydrogen peroxide,H2O2)是細(xì)胞有氧代謝的產(chǎn)物,也是植物體細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答逆境脅迫的信號分子,廣泛參與植物體的抗性反應(yīng)[4],且對植物體生理作用有雙重性(迫害和保護(hù)),即低濃度H2O2則會提高植物的抗逆性,而高濃度H2O2會對植物體的生長發(fā)育起著抑制作用,甚至?xí)?dǎo)致植物體的死亡[5]。已有大量研究結(jié)果證明H2O2能促進(jìn)種子萌發(fā):外源H2O2浸種可以明顯提高小白菜種子耐鹽性[6];過氧化氫浸種預(yù)處理通過降低ABA含量和提高GA含量來提高棉花種子萌發(fā)的耐鹽性[7];外源H2O2浸種能增強(qiáng)皂角種子的萌發(fā)率[8];過氧化氫浸種預(yù)處理可以明顯緩解低溫對花生種子的傷害[9]。

豌豆(PisumsativumL.)是一年生或越年生草本植物[10],也是世界上第四大食用豆類作物。中國是蔬菜豌豆主要生產(chǎn)國[11],種植范圍遍布全國多個省份,且豌豆是深受人們喜愛的豆類食品之一。在食品功效方面,研究發(fā)現(xiàn)豌豆具有抗氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等作用[12]。近年,土壤安全問題越來越受到關(guān)注,其中土壤鹽堿化成為全球熱點問題。隨著土壤鹽堿化程度的增加,豌豆種子萌發(fā)和幼苗生長受到抑制,從而導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)大幅度下降[13]。因而通過外源物質(zhì)提高豌豆種子萌發(fā)對鹽的耐受性[14],緩解鹽脅迫對豌豆種子萌發(fā)的毒害作用變得非常重要。目前有關(guān)外源H2O2在豌豆抗鹽方面的研究報道很少。因此,本試驗研究外源H2O2對豌豆種子萌發(fā)和幼苗生長鹽脅迫的緩解機(jī)制,確定適宜的外源H2O2濃度,旨在為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用外源物質(zhì)提高作物抗鹽堿能力提供實踐指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用豌豆種子,由甘肅省隴東生物資源保護(hù)利用與生態(tài)修復(fù)重點實驗室提供。氯化鈉和30%過氧化氫等藥品均為分析純。

1.2 試驗設(shè)計與方法

1.2.1 NaCl濃度的篩選 NaCl溶液濃度設(shè)定參考達(dá)海蘭[15]的方法,模擬鹽脅迫。選擇大小均一品質(zhì)良好的豌豆種子,用10 ml含量0.5%的NaClO溶液消毒15 min,然后用自來水沖洗3次,用濾紙吸干種子表面的水分,將種子播于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中,每只培養(yǎng)皿播50粒種子。分別取10 ml不同濃度(17 mmol/L、34 mmol/L、68 mmol/L、85 mmol/L、102 mmol/L、136 mmol/L、170 mmol/L)的NaCl 溶液加入培養(yǎng)皿中,以蒸餾水為對照,共8個處理,每個處理重復(fù)3次,操作重復(fù)3次。將所有處理放于(25±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察和統(tǒng)計發(fā)芽數(shù),補(bǔ)充相應(yīng)的溶液,7 d后對其相關(guān)指數(shù)進(jìn)行計算。

1.2.2 外源H2O2浸種處理 由不同濃度NaCl溶液對豌豆種子的處理結(jié)果可知,170mmol/L濃度NaCl溶液脅迫效果最佳。選擇大小均一、品質(zhì)良好的豌豆種子,用10 ml含量0.5%的NaClO溶液消毒15 min,然后用自來水沖洗3次,用濾紙吸干種子表面的水分,分別用170 mmol/L濃度NaCl溶液及5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L濃度H2O2溶液將豌豆種子浸種8 h,同時以蒸餾水浸種為對照浸種相同時間。之后用蒸餾水沖洗3次,用慮紙吸干種子表面殘留的水分,將種子分別放入鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中,每只培養(yǎng)皿放50粒種子,分別加入等量170 mmol/L濃度NaCl溶液。以蒸餾水為對照,共7個處理組,每組至少重復(fù)3次,操作重復(fù)3次。處理分別為CK:蒸餾水;CG:170 mmol/L NaCl溶液;T1:5 mmol/L H2O2溶液+170 mmol/L NaCl溶液;T2:10 mmol/L H2O2溶液+170 mmol/L NaCl溶液;T3:20 mmol/L H2O2溶液+170 mmol/L NaCl溶液;T4:40 mmol/L H2O2溶液+170 mmol/L NaCl溶液;T5:80 mmol/L H2O2溶液+170 mmol/L NaCl溶液。

將所有處理放于(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每日觀察并統(tǒng)計發(fā)芽數(shù),補(bǔ)充相應(yīng)的溶液,7 d后對其相關(guān)指數(shù)進(jìn)行計算。此外,7 d后取豌豆根和芽用于相關(guān)生理指標(biāo)測定。

1.3 相關(guān)指數(shù)測定及方法

1.3.1 種子萌發(fā)期指標(biāo)的測定 以根長大于2 mm作為豌豆種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn),種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)、抗鹽性指數(shù)和根相對鹽迫害率計算參考李志萍等[16]的方法。

發(fā)芽率=(N7/N)×100%

式中,N7為第7 d的發(fā)芽個數(shù),N為所供試豌豆種子數(shù)。

發(fā)芽勢=(N3/N)×100%

式中,N3為第3 d發(fā)芽個數(shù),N為所供試豌豆種子數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)(Gi)=∑Gt/Dt

式中,Gt為在時間t日的發(fā)芽數(shù),Dt為發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)=S×Gi

式中,S為幼苗平均根長,Gi為發(fā)芽指數(shù)。

抗鹽性指數(shù)=(S×Gi)*/(S×Gi)×100%

式中,(S×Gi)*為CG、T1～T5處理活力指數(shù),(S×Gi)為CK活力指數(shù)。

相對鹽迫害率=(L-L*)/L×100%

式中,L*為CG、T1～T5處理根長,L為CK根長。

1.3.2 各項生理指標(biāo)的測定 種子的發(fā)芽試驗結(jié)束后,每組隨機(jī)挑取15株豌豆苗,用直尺和棉線測定幼苗的芽長和根長,計算平均長度(cm);用千分之一天平稱量芽鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量,計算平均值(g)。

1.3.3 脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量的測定 脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量的測定參照李志萍等[16]的方法。

1.3.4 抗氧化酶活性的測定 待測液的提取:用稱量紙稱取0.1 g待測品,放入研缽中,加入預(yù)冷的適量50 mmol/L磷酸緩沖溶液(含有5.0 mmol/L DTT、0.1mmol/L EDTA、1% PVP,pH=7.0)研磨充分,迅速轉(zhuǎn)移到離心管中,10 000g離心15 min。去除離心管中沉淀即為所需酶液。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫(CAT)測定參照李志萍等[16]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,利用 SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析,利用Duncan’s法進(jìn)行多重比較及差異顯著性分析(α=0.05)。表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl溶液對豌豆種子萌發(fā)的影響

由表1可知,與CK相比,17 mmol/L、34 mmol/L、68 mmol/L、85 mmol/L、102 mmol/L、136 mmol/L、170 mmol/L濃度NaCl溶液處理豌豆種子的發(fā)芽率分別降低14.74%、18.59%、21.72%、24.05%、24.81%、27.79%及48.82%;發(fā)芽勢分別降低了14.14%、21.69%、50.03%、53.67%、56.99%、64.60%及75.52%; 根長分別降低了5.35%、11.29%、11.68%、14.06%、16.63%、29.90%及47.13%;發(fā)芽指數(shù)分別降低了15.80%、17.32%、20.34%、21.94%、26.23%、39.08%及56.41%;活力指數(shù)分別降低了20.30%、26.66%、29.65%、31.99%、38.51%、57.30%及76.95%。與CK相比,170 mmol/L濃度NaCl溶液處理顯著抑制了豌豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)(P<0.05),其對發(fā)芽率、根長、發(fā)芽指數(shù)的抑制程度為50.0%左右,因此選擇170 mmol/L濃度NaCl溶液作為豌豆鹽脅迫的最佳濃度。

表1 不同濃度NaCl溶液對豌豆種子萌發(fā)的影響

2.2 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆種子萌發(fā)的影響

由表2可知,與CK相比,CG處理顯著抑制了豌豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)(P<0.05), 發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)分別降低了48.84%、75.48%、56.41%、76.95%。與CG處理相比,T1～T4處理豌豆種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著提高(P<0.05)。與CG處理相比,T1處理豌豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別提高了105.13%、833.70%、201.38%和683.32%。隨著H2O2濃度的增大,T1～T5處理豌豆種子的萌發(fā)各項指標(biāo)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。結(jié)果表明,外源5 mmol/L H2O2處理(T1)能有效緩解鹽對豌豆種子萌發(fā)的抑制,并存在濃度效應(yīng),表現(xiàn)為在鹽脅迫下,低濃度H2O2促進(jìn)豌豆種子萌發(fā)。

表2 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

2.3 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆幼苗生長的影響

由表3可知,與CK相比,CG處理豌豆幼苗的根長和芽長顯著降低(P<0.05),根長和芽長分別降低了47.13%、34.18%。隨著H2O2濃度的增加,T1～T5處理豌豆幼苗的根長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中T1處理緩解豌豆鹽脅迫效果最佳,與CG處理相比,T1處理豌豆幼苗根長顯著增加159.93%(P<0.05)。T1～T5處理豌豆幼苗的芽長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中T1處理緩解豌豆鹽脅迫效果最好,與CG處理相比, T1處理豌豆幼苗芽長顯著增加150.00%。

表3 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆幼苗根長、芽長、根鮮質(zhì)量及芽鮮質(zhì)量的影響

由表3可知,與CK相比,CG處理豌豆幼苗的根鮮質(zhì)量和芽鮮質(zhì)量顯著降低(P<0.05),且根、芽鮮質(zhì)量分別降低了22.68%、12.97%。隨著H2O2濃度的增加,T1～T5處理豌豆幼苗的根鮮質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中T1處理緩解鹽脅迫的效果最好,與CG處理相比,T1處理豌豆幼苗的根鮮質(zhì)量顯著增加87.52%(P<0.05)。而T5處理豌豆幼苗的根鮮質(zhì)量低于CG處理。T1～T5處理豌豆幼苗的芽鮮質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。與CG處理相比,T1、T2、T3處理豌豆幼苗的芽鮮質(zhì)量分別顯著增加了109.67%、97.75%、93.65% (P<0.05)。其中T1處理豌豆幼苗的芽鮮質(zhì)量最高,而T5處理豌豆幼苗的芽鮮質(zhì)量低于CG處理。表明外源H2O2緩解鹽脅迫存在濃度效應(yīng),表現(xiàn)為低濃度H2O2促進(jìn)豌豆幼苗生長。

2.4 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆種子萌發(fā)抗鹽性指數(shù)和相對鹽迫害率的影響

抗鹽性指數(shù)是指種子萌發(fā)對不同濃度NaCl溶液的耐受能力。種子萌發(fā)后幼苗根長受鹽脅迫的程度,稱為根長相對鹽迫害率。從表4可看出,CG處理豌豆種子萌發(fā)的抗鹽性指數(shù)為CK的23.05% (P<0.05)。隨著H2O2濃度的增加,T1～T5處理豌豆種子萌發(fā)抗鹽性指數(shù)不斷降低(P<0.05),且T1～T3處理豌豆種子萌發(fā)抗鹽性指數(shù)高于CG處理,其中T1處理豌豆種子萌發(fā)抗鹽性指數(shù)最高,比CG處理顯著提高了683.30%(P<0.05)。T5處理抗鹽性指數(shù)最小,為17.90%。隨著H2O2濃度的增加,T1～T5處理相對鹽迫害率呈上升趨勢,其中T3～T5處理相對鹽迫害率高于CG處理,T1處理相對鹽迫害率最低,為-37.43%,表明低濃度外源過氧化氫不僅能緩解鹽脅迫對豌豆根造成的損傷,還能促進(jìn)根的生長,這與表3的結(jié)果相一致。

表4 外源H2O2處理對NaCl脅迫下豌豆種子萌發(fā)抗鹽性指數(shù)和相對鹽迫害率的影響

2.5 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和丙二醛含量的影響

脯氨酸和可溶性糖是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),其含量的高低直接影響植物體的抗逆性[9]。由表5可知,T1～T4處理豌豆幼苗根和芽中脯氨酸和可溶性糖含量均高于CG處理,其中T1處理豌豆幼苗根和芽中脯氨酸含量和可溶性糖含量最高。相較于CG處理,T1處理豌豆幼苗根和芽中脯氨酸含量分別提高了40.00%、70.27%,可溶性糖含量分別提高了21.03%、11.53%。

丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物,其含量的高低可反映植物過氧化損傷的程度。由表5可知,與CK相比,CG處理的豌豆幼苗根和芽中丙二醛含量顯著升高(P<0.05),T1處理豌豆幼苗的根和芽中丙二醛含量顯著低于CG處理,說明低濃度H2O2處理可明顯緩解NaCl脅迫對豌豆組織的損傷,隨著H2O2濃度的不斷升高,作用緩慢削弱。各個處理相比較,T1處理根和芽中丙二醛含量最低。

表5 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆幼苗根和芽中脯氨酸、可溶性糖及丙二醛含量的影響

2.6 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆幼苗抗氧化酶活性的影響

由表6可知,與CK相比,CG處理顯著抑制了豌豆幼苗芽中CAT活性(P<0.05),T1處理豌豆幼苗根和芽中CAT的活性最高。與CG相比,T1、T2處理豌豆幼苗根和芽中CAT的活性顯著提高(P<0.05)。但高濃度的H2O2處理CAT活性降低。

由表6可知,與CK相比,CG處理豌豆幼苗根和芽中的SOD、POD活性均顯著提高(P<0.05)。T1處理豌豆幼苗根和芽中的SOD、POD活性最高,與CG處理相比分別提高了45.53%、28.07%,21.06%、28.48%(P<0.05)。隨著H2O2濃度的升高,豌豆幼苗根和芽中的SOD、POD活性均先升高后降低,但都高于CK。

表6 外源H2O2對NaCl脅迫下豌豆根和芽中CAT、SOD和POD活性的影響

3 討 論

土壤鹽漬化是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中影響作物產(chǎn)量的因素之一,會導(dǎo)致植物體對養(yǎng)分的難以吸收、土壤板結(jié)造成植物體無法生長發(fā)育[17]。鹽脅迫會直接影響種子的發(fā)芽和幼苗生長,進(jìn)而會影響其后期的產(chǎn)量[18]。本研究結(jié)果表明,不同濃度NaCl溶液處理,豌豆種子的萌發(fā)均受到抑制。170 mmol/L濃度NaCl溶液處理顯著抑制了豌豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和幼苗的生長。這與NaCl處理對甜高粱[18]、小白菜[19]和油菜[20]種子萌發(fā)的影響一致。

H2O2是一種重要的抗逆信號分子[21],參與種子萌發(fā)、各種脅迫響應(yīng)、植物生長發(fā)育和細(xì)胞程序性死亡等生理過程[22]。本研究結(jié)果表明,5 mmol/L濃度H2O2能夠顯著緩解NaCl脅迫對豌豆種子的萌發(fā)和幼苗生長的抑制,并存在濃度效應(yīng),表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)。這與外源H2O2浸種能緩解NaCl脅迫對燕麥[23]、小白菜[19]和小麥[24]幼苗生長的抑制結(jié)果相一致。

非生物脅迫使活性氧的產(chǎn)生和清除機(jī)制失衡,造成自由基產(chǎn)生過多,膜脂氧化嚴(yán)重,最終對植物種子的萌發(fā)和幼苗生長造成傷害[25]。本研究發(fā)現(xiàn),與CK相比,170 mmol/L濃度NaCl溶液處理(CG)顯著抑制了豌豆幼苗中CAT的活性,提高了SOD和POD活性,這表明豌豆幼苗啟動抗氧化酶系統(tǒng)來抵抗更多活性氧的產(chǎn)生。H2O2可以激活非生物脅迫下,植物細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)來抵抗更多活性氧對機(jī)體造成的傷害[21]。已有研究結(jié)果表明,在鹽脅迫下,外源H2O2提高了苦菜幼苗中SOD、POD、CAT和APX酶的活性及可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和脯氨酸含量,降低了細(xì)胞內(nèi)H2O2和丙二醛含量[26]。外源H2O2增強(qiáng)了鹽脅迫下小白菜幼苗中SOD、CAT和APX的活性,降低丙二醛含量,以此來抵抗鹽脅迫帶來的氧化損傷[19]。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致,表明H2O2是參與豌豆抗氧化酶系統(tǒng)的重要信號分子。

植物在遭受非生物脅迫時,會發(fā)生滲透脅迫[27]。脯氨酸[28-32]和可溶性糖[33-35]是重要的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),參與多種非生物脅迫[36]。已有研究結(jié)果表明,在遭受堿脅迫后,水稻通過可溶性糖含量的變化,調(diào)節(jié)脯氨酸含量,來提高自身的抗逆性[37]。鹽脅迫下,桑樹葉片中的脯氨酸大量積累[38]。低溫下,塔胞藻胞內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖含量增加[39]。NADPH氧化酶介導(dǎo)的H2O2通過調(diào)節(jié)脯氨酸的生物合成和降解來減輕鹽脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷[40]。由NADPH氧化酶產(chǎn)生的過氧化氫增加了擬南芥在鹽或甘露醇脅迫過程中脯氨酸的積累[41]。本研究發(fā)現(xiàn),與CG相比,外源5 mmol/L H2O2浸種能提高鹽脅迫下豌豆幼苗中脯氨酸和可溶性糖含量,增強(qiáng)了細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力,提高了豌豆幼苗的抗鹽能力。

4 結(jié) 論

綜上所述,與CG相比,外源5 mmol/L H2O2能夠顯著提高豌豆幼苗中SOD、CAT和POD的活性,降低丙二醛含量,促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累,減輕鹽脅迫造成的氧化損傷,因此顯著提高了豌豆種子萌發(fā)的耐鹽性,促進(jìn)其幼苗生長。