QuEChERS 結(jié)合優(yōu)化的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定韭菜中9 種易殘留農(nóng)藥

王 晗，丁 爽，李海平

（鋼研納克檢測(cè)技術(shù)股份有限公司，北京 100081）

韭菜屬多年生宿根性蔬菜，富含蛋白質(zhì)、纖維素、多種維生素、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，深受消費(fèi)者喜愛，市場(chǎng)需求量巨大[1]。然而韭菜極易遭受病害侵襲，尤其在大棚溫室等冬春季韭菜生產(chǎn)地中，韭菜灰霉病、韭蛆等危害尤為突出[2]。為保證韭菜的產(chǎn)量和質(zhì)量，藥劑防治仍是目前田間防控該病害較常采用的措施[3]。這些農(nóng)藥主要以灌根的方式投入韭菜生產(chǎn)，導(dǎo)致土壤中殘留的農(nóng)藥量非常大，從土壤環(huán)境中吸收農(nóng)藥后的韭菜被消費(fèi)者食用后，產(chǎn)生急性中毒事件時(shí)有曝光，造成了非常不好的社會(huì)影響[4]。相關(guān)研究顯示[5-7]，相比于其他農(nóng)藥，多菌靈、腐霉利、吡蟲啉、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊靈、氧樂果這9 種農(nóng)藥在韭菜中更易殘留，當(dāng)前亟需建立一種簡單、快速、高效的方法，針對(duì)性地用于檢測(cè)韭菜中的易殘留農(nóng)藥。

目前，常見的農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)主要有氣相色譜法[8-9]、液相色譜法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12-13]、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[14-15]和液相色譜-質(zhì)譜/ 質(zhì)譜法[16-17]。其中，氣相色譜法、液相色譜法對(duì)前處理要求高、定性能力弱、適用范圍窄，而且抗干擾能力差，容易引起假陽性；氣相色譜-質(zhì)譜法為低分辨質(zhì)譜，當(dāng)樣品基質(zhì)復(fù)雜時(shí)，特別是質(zhì)荷比接近的目標(biāo)物和干擾物不能有效地區(qū)分，同樣會(huì)出現(xiàn)假陽性而造成誤判；而氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，通過選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描，選擇特征母離子與子離子，可有效減少基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，現(xiàn)逐漸發(fā)展為農(nóng)藥多殘留分析的主要檢測(cè)技術(shù)[18]。但相比于氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法對(duì)于前處理的要求更低且耗時(shí)更短。

常用的農(nóng)殘前處理方法主要有固相分散萃取法、固相萃取法、凝膠滲透色譜法以及QuEChERS 法，韭菜的基質(zhì)十分復(fù)雜，在其農(nóng)藥殘留檢測(cè)過程中，傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)不易實(shí)現(xiàn)基質(zhì)成分的有效凈化，對(duì)農(nóng)藥檢測(cè)容易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性[19]。QuEChERS 法通過吸附劑填料與基質(zhì)中雜質(zhì)的相互作用來達(dá)到吸附除雜的目的，其前處理簡便、快速，現(xiàn)已成為動(dòng)植物性食品中農(nóng)藥殘留的主要前處理技術(shù)之一。

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，結(jié)合QuEChERS 前處理技術(shù)，針對(duì)韭菜中容易檢出的多菌靈、腐霉利、吡蟲啉、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊靈、氧樂果等農(nóng)藥，建立了一種適用于檢測(cè)韭菜中上述9 種農(nóng)殘的分析方法，儀器檢測(cè)時(shí)間僅需4 min，定性定量準(zhǔn)確，方法簡便快捷，大大提高了檢測(cè)效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰性韭菜粉，鋼研基地自產(chǎn)；多菌靈、腐霉利、吡蟲啉、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊靈、氧樂果的標(biāo)準(zhǔn)溶液，含量均為1 000 mg/kg，壇墨質(zhì)檢；乙腈、甲醇、甲酸，均為色譜純，阿拉丁試劑公司；乙酸銨、無水硫酸鎂、氯化鈉，麥克林；乙二胺-N-丙基硅烷/PSA、石墨化炭黑/GCB，山東美正生物科技有限公司；50mL 離心管，廣州潔特生物過濾股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜，Waters UPLC-AB SCIEX QTRAP 5500，配電噴霧離子源，美國AB SCIEX；多孔渦旋振蕩器，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；IKA 漩渦混合器，艾卡儀器設(shè)備有限公司；濾膜，0.22 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；1/100 電子天平，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；TD5 臺(tái)式低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

稱取1 g 陰性韭菜粉，加入9 mL 超純水，復(fù)溶成10 g 韭菜樣本。向其中加入10 mL 乙腈，加入4 g 無水硫酸鎂、1 g 氯化鈉，劇烈振蕩15 min，4 000 r/min離心5 min，取4 mL 上清液倒入裝有0.6 g 無水硫酸鎂、0.1 g PSA、0.01 g GCB 的離心管中，劇烈振蕩3 min，4 000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm 有機(jī)濾膜備用。

1.3.2 儀器條件

色譜條件：ACQUITY UPLCD HSS C18 SB 色譜柱，粒徑1.8 μm，100 mm×2.1 mm，美國Waters 公司；流動(dòng)相組成及洗脫梯度如表1 所示；柱溫40 ℃；流速為0.40 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。

表1 流動(dòng)相組成及洗脫梯度

質(zhì)譜條件，電離方式：ESI+；MRM 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子化電壓：5 500 V；氣簾氣壓力35 psi；干燥氣溫度：550 ℃；噴霧器壓力：55 psi；輔助加熱器壓力：55 psi；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及碰撞能量見表2。

表2 9 種農(nóng)藥在UPLC-MS/MS 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的檢測(cè)條件

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及基質(zhì)效應(yīng)

溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L 的9 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于-20 ℃保存，備用。再以質(zhì)量濃度為10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液為母液，用乙腈逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。按照1.3.2 的條件上機(jī)測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以待測(cè)農(nóng)藥的峰面積為縱坐標(biāo)，通過Analyst software 繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：以質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液為母液，用1.3.1 中處理得到的韭菜陰性基質(zhì)液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L 的系列基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。按照1.3.2 的條件上機(jī)測(cè)定，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以待測(cè)農(nóng)藥的峰面積為縱坐標(biāo)，通過Analyst software繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)：本文通過計(jì)算基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程[式（1）]斜率比進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)（ME）評(píng)價(jià)。

根據(jù)ME 為正值還是負(fù)值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)為增強(qiáng)或減弱效應(yīng)。其中，當(dāng)-20%＜ME＜20%時(shí)，通常認(rèn)為是弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)-50%＜ME＜-20%或20%＜ME＜50%時(shí)，為中等程度基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＜-50%或50%＜ME時(shí)，為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)；中等程度基質(zhì)效應(yīng)和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)都需要進(jìn)行基質(zhì)補(bǔ)償[21]。

1.3.4 添加回收率實(shí)驗(yàn)

稱取陰性韭菜樣品，設(shè)定10、50、100、200 μg/kg 4 個(gè)添加水平，每個(gè)添加水平設(shè)置6 個(gè)重復(fù)，另設(shè)空白對(duì)照，按照1.3.1 所述的方法進(jìn)行前處理，按照1.3.2的條件上機(jī)測(cè)定，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)及流動(dòng)相的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在ESI+模式下，用針泵以7.5 μL/min 的流速將質(zhì)量濃度為500 μg/L 的9 種農(nóng)殘單標(biāo)注入質(zhì)譜儀，進(jìn)行全掃描，獲得加合離子峰，以其作為母離子進(jìn)行轟擊，獲得碎片離子。選擇響應(yīng)較強(qiáng)的2 個(gè)碎片離子和母離子組成2 對(duì)監(jiān)測(cè)離子對(duì)。在MRM 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，對(duì)碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）等參數(shù)逐一進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化獲得的MRM 離子對(duì)及質(zhì)譜條件見表2。

本實(shí)驗(yàn)考察了：①水+甲醇、②水+乙腈、③0.1%甲酸水+甲醇、④0.1%甲酸水+乙腈、⑤2 mol/L 乙酸銨-0.1%甲酸水+甲醇，5 組不同流動(dòng)相對(duì)化合物峰形和響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，使用流動(dòng)相②、④時(shí)，腐霉利響應(yīng)很低。使用流動(dòng)相①、③、⑤時(shí)，9 種物質(zhì)均能正常出峰，且響應(yīng)信號(hào)逐漸升高，峰形也逐步得到改善。因此，本實(shí)驗(yàn)最終采用2 mol/L 乙酸銨-0.1%甲酸水+甲醇溶液作為流動(dòng)相。甲酸的加入能提供H+質(zhì)子，有助于化合物電離的同時(shí)也提高了背景化合物的響應(yīng)。乙酸銨的加入使得流動(dòng)相離子強(qiáng)度增加，電子轉(zhuǎn)移速率增加，目標(biāo)化合物和背景化合物同時(shí)抑制電離，乙酸銨在一定濃度下，可提高目標(biāo)化合物的信噪比[22]。9 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.0 μg/L）在韭菜樣品基質(zhì)中的提取離子流圖見圖1。

圖1 9 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在韭菜樣品基質(zhì)中的提取離子流圖

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

如表3 所示，腐霉利和甲胺磷表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，二甲戊靈幾乎沒有基質(zhì)效應(yīng)，其余6 種農(nóng)藥在韭菜中均為基質(zhì)減弱效應(yīng)。根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)對(duì)應(yīng)范圍，除氧樂果在韭菜中表現(xiàn)為中等程度基質(zhì)效應(yīng)外，其余農(nóng)藥基均為弱基質(zhì)效應(yīng)。

表3 9 種農(nóng)藥在韭菜中的基質(zhì)效應(yīng)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的考察

綜合考慮9 種化合物的基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，如表4 所示，多菌靈在1～200 μg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)為0.991 1，腐霉利在5～500 μg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)為0.999 1，其余7 種化合物在1～500 μg/kg范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性系數(shù)在0.997 0～1.000 0 之間。

表4 9 種農(nóng)藥的線性方程、線性系數(shù)和線性范圍

2.4 方法的回收率與精密度

如表5 所示，在10、50、100、200 μg/kg 4 個(gè)添加水平下，9 種農(nóng)藥在韭菜中的平均回收率在70%～115%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.6%～6.7%之間，結(jié)果表明本試驗(yàn)所建立的方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足韭菜中易檢出農(nóng)殘的分析檢測(cè)要求。根據(jù)NY/T 788—2018[23]規(guī)定，以最低添加水平作為方法的定量限（LOQ），則9 種農(nóng)藥的定量限均為0.01 mg/kg，且均低于本實(shí)驗(yàn)研究的9 種農(nóng)藥在韭菜中的最高殘留限量[24]。

表5 9 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS 前處理方法結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)韭菜中多菌靈、腐霉利、吡蟲啉、啶蟲脒、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲胺磷、二甲戊靈、氧樂果9 種農(nóng)藥，建立了一種針對(duì)性檢測(cè)韭菜中9 種易殘留農(nóng)藥的方法。9 種農(nóng)藥中，多菌靈在1～200 μg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，腐霉利在5～500 μg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其余7 種化合物在1～500 μg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)均大于0.99，方法的定量限為10 μg/kg。在10、50、100、200 μg/kg 添加水平的回收率在70%～115%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.6%～6.7%之間（n=6）。本研究所建立的檢測(cè)方法，前處理時(shí)間短，色譜及質(zhì)譜條件經(jīng)過優(yōu)化，峰形好、化合物在儀器中的響應(yīng)高，方法簡單、快速、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求，適用于韭菜樣品中9 種易殘留農(nóng)殘的檢測(cè)。