土壤微生物環(huán)保修復技術(shù)的具體應用

王 駿，蔣莎莎，余 敏

（1.浙江交科環(huán)境科技有限公司，浙江 杭州 310000；2.溫嶺市環(huán)境綜合整治事務中心，浙江 臺州 317500；3.浙江秀水環(huán)保有限公司，浙江 杭州 310000）

0 引言

土壤污染作為一種非常復雜的環(huán)境問題，其具有隱蔽性、潛伏性、持續(xù)性、廣泛性等特點，如果不對其進行有效治理，將會產(chǎn)生嚴重的環(huán)境污染后果。隨著我國城市化進程的不斷加快，城市垃圾、工業(yè)廢棄物、農(nóng)藥化肥等各種固體廢棄物源源不斷地流入農(nóng)村地區(qū)，在不斷的積累下，這些固體廢棄物已經(jīng)嚴重污染了土壤環(huán)境[1]。土壤污染已經(jīng)成為了我國農(nóng)村地區(qū)主要的環(huán)境問題之一，也是影響我國農(nóng)業(yè)發(fā)展和農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展的主要原因之一。近年來，國家也開始高度重視土壤污染問題，并將其作為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成部分進行全面推進。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與設備

實驗土壤：從某石油化工管線輸送公司的工廠場地中采集，經(jīng)過14 d 的陳化后，用30 目（0.613 mm）篩篩選后將其冷凍、干燥處理，并置于4℃的避光室中保存，稱為CK。該土壤為粉砂質(zhì)壤土，其石油烴含量為16 622.89 mg/kg，pH 值為8.37，含水量為1.57%，電導率為154 μS/cm，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為3.7%，氧化還原電位為86 mV，陽離子交換容量為0.088 mol/kg，總碳質(zhì)量分數(shù)為3.8%，總氮含量為937 mg/kg，以及總磷含量為720 mg/kg。

用于TPHs 降解的特定細菌：通過內(nèi)部培養(yǎng)及篩選技術(shù)，獲得一株能在低溫環(huán)境（＜15 ℃）下生長的細菌株，歸類于霍氏腸桿菌屬，本實驗中標記為GZ6。該種細菌不僅能夠合成生物表面活性物質(zhì)，而且能夠?qū)θ缺椒舆M行降解[2]。

實驗試劑包括過硫酸鈉、鐵粉、FeSO4·7H2O、正己烷、丙酮、β-環(huán)糊精。

實驗儀器包括氣相色譜儀、便攜式ORP/DO/pH/EC儀、可見光分光光度計、氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀等。

1.2 實驗設計

采用過硫酸鹽氧化（PS 氧化）和過硫酸鹽氧化-微生物（PS 微生物）修復兩種方案，每種實驗方案均設置實驗組和對照組。其中，PS 氧化實驗方案對照組將1.5%的PS、0.071%的鐵粉和0.876%的FeSO4·7H2O（其中百分數(shù)分別為對應物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)，下同）的溶液混合后加入實驗土壤匯總，土壤和實驗藥劑質(zhì)量比為10∶（8～10），該對照組記為OX1。實驗組在OX1 的基礎上加入0.357%的β-環(huán)糊精螯合劑，該實驗組記為OX2；PS 微生物實驗方案對照組與OX1相同，同時采用土著菌微生物修復土壤，記為CB。實驗組與OX2 相同，微生物采用GZ6 菌，記為CMB。

在PS 微生物修復實驗流程中，0～12 d 設定為PS氧化修復階段，隨后的13～17 d 為過渡期，此時土壤完成PS 氧化后接受微生物修復的準備，而從18～60 d則為微生物修復階段。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤理化特性分析

對于土壤中的總石油烴（TPHs）含量，采用HJ 1021—2019 標準的氣相色譜法進行定量分析；土壤的電導率（EC）依照HJ802—2016 標準的電極法進行測量；為評估土壤的氧化還原電位（ORP），執(zhí)行HJ 746—2015 標準的電位法；土壤pH 值的測定遵循HJ 962—2018 標準的電位法；使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）檢測土壤微生物修復階段中分解代謝產(chǎn)物的變化[3]。

1.3.2 土壤酶活性分析

用改良三苯基四唑氯化物還原方法（按三苯基甲胺1 h 內(nèi)在1 g 土壤中的產(chǎn)出率計算）檢測土壤中的脫氫酶活力；土壤中脂解酶活性的測定采用分光光度測量技術(shù)；同時，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和基因序列的比對分析則利用SOAP aligner 軟件平臺進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤中TPHs 及其組分的修復期變化情況

2.1.1 TPHs 的時序變化趨勢

圖1 為不同處理時期污染土壤中石油烴含量變化情況。從圖1 可以看出，經(jīng)過PS 氧化實驗后，PS 微生物實驗土壤中TPHs 含量呈現(xiàn)快速下降趨勢；當經(jīng)過12d 的處理后，CB 和CMB 處理的土壤中TPHs 含量從初始的16 521.76 mg/kg 降至7 523.61 mg/kg 和7 848.80 mg/kg，去除率分別達到了53.9%和52.7%。結(jié)果表明，在PS 氧化實驗的早期階段，β-環(huán)糊精對于TPHs 降解的促進作用并不明顯。可能是由于螯合劑及土壤中的有機質(zhì)與污染物之間發(fā)生了自由基競爭作用，從而影響了PS 的有效利用率。

圖1 污染土壤中TPHs 含量隨修復時間的變化

隨著修復進程的延續(xù)，CB 與CMB 處理策略下的TPHs 水平持續(xù)降低。在處理的第60d，CB 與CMB 方法處理后的土壤TPHs 含量分別降至4 632.61 mg/kg和2 715.76 mg/kg，對應的TPHs 去除效率達到了72.1%和82.3%。與CB 方案相比，CMB 方案在去除TPHs 方面的效率提升了29.6%，顯著優(yōu)于CB 方案。

CB 方案中采用了鐵離子（Fe2+）激活的氧化微生物修復策略，而CMB 方案結(jié)合了β-環(huán)糊精螯合鐵離子激活的氧化微生物。通過兩種策略的比較分析，明顯可以看出β-環(huán)糊精通過螯合Fe2+延長了激活劑的作用時間，并減緩了游離基團對土壤和微生物的負面影響，從而為微生物修復創(chuàng)造了有利條件。此外，引入GZ6 功能性微生物不僅為生物修復和化學氧化的間隔期提供了降解石油烴的有效菌種，還能通過降低原油的表面張力來增強石油的溶解性和降低黏度，進而提升對TPHs 的降解能力。

2.1.2 TPHs 餾分變化

圖2 為受污染的土壤中，各種TPHs 組份的含量隨時間變化情況。TPHs 各組份的降解性從大到小分別是C31～C40、C18～C30、C10～C17。

圖2 污染土壤中不同TPHs 餾分含量的變化

從圖2 可以看出，CK 中，C10～C17 餾分的含量為10 986.69 mg/kg，含量最高；C31～C40 餾分的含量為169.29 mg/kg，含量最低；C18～C30 餾分的含量為5 398.01 mg/kg；PS 對OX1 和OX2 的餾分進行了深度氧化后，OX1 中C10～C17 的脫除率達到了45.1%，OX2 中C10～C17 的脫除率達到了71.2%。

在實驗期60 d 內(nèi)，CB 實驗方案中C10～C17 餾分的總含量為2 594.05 mg/kg 脫除率為76.1%；C18～C30 的總含量為2 048.30 mg/kg，脫除率為79.1%；C31～C40 的總含量為36.15 mg/kg，脫除率為78.9%；CMB 實驗方案中C10～C17 餾分總含量為1 321.53 mg/kg，脫除率為87.8%；C18～C30 餾分總含量為1 426.55 mg/kg，脫除率為74.1%；C31～C40 餾分為41.29 mg/kg，脫除率為73.1%。

與CB 實驗方案相比，CMB 實驗方案中C10～C17和C18～C30 去除率有較大幅度的提升，提升幅度分別為12%、11.5%，由此可見CMB 實驗方案修復土壤效果優(yōu)于CB 實驗方案。

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對TPHs 的分解產(chǎn)物進行分析。檢測到的降解產(chǎn)物類別包括長鏈烷烴、烯烴、支鏈烷烴、芳香烴以及環(huán)烷烴等類型，具體化合物涵蓋環(huán)己烷、鄰苯二甲酸酯、苯酚、C15～C20 的長鏈烷烴以及其他支鏈化合物，其中主要以中鏈烷烴為主要成分。長鏈烷烴（C25～C40）因其為固態(tài)疏水性化合物、溶解度較低而難以被生物作用降解；然而，GZ6 菌株能通過分泌生物表面活性劑來增加TPHs 的溶解度，從而提升其降解效率。

2.2 修復期間土壤化學性質(zhì)的變化

圖3 為不同處理時期的土壤pH 值、EC 值和ORP 值的變化情況。從圖3-1 可以看出，在PS 氧化期，CB 和CMB 兩種修復方案中土壤的pH 值都有較大幅度的下降，在12 d 后，pH 值從最初的8.25 分別下降到7.79 和7.80；在修復時間60 d 后，兩種修復方案下的土壤pH 值分別上升到7.86 和7.90。

圖3 土壤pH、EC、ORP 隨修復時間的變化

從圖3-2 可以看出，在PS 氧化期，CB 和CMB 實驗方案的土壤中的EC 都有較大幅度的增長，在12 d修復期間，EC 由152.4 μS/cm 的最初值分別上升到3 018 μS/cm 和3 101 μS/cm。EC 急劇增加由于在修復過程中引入的亞鐵活化劑和PS 氧化作用生成了額外的離子，這些離子的增多導致EC 值的顯著提高。隨著修復治療的持續(xù)，硫酸根（SO42-）和鈣離子（Ca2+）等可能會以礦物的形式沉淀，同時部分可溶解的礦物質(zhì)會被微生物吸收并代謝。當修復時間達到60d 的時候，CB 和CMB 土壤的EC 逐步下降到1 449 μS/cm和1 720 μS/cm。

從圖3-3 可以看出，在PS 氧化期，CB 和CMB 兩種實驗方案的土壤中的ORP 快速升高，在12 d 后，ORP 從最初的86 mV 分別升高到126 mV 和145 mV；在60 d 后，CB 實驗方案的ORP 值達到162 mV，而CMB 實驗方案的ORP 值則達到169 mV。CMB 實驗方案的ORP 較CB 有顯著升高，主要是由于GZ6 與土壤降解菌群之間存在著相互協(xié)作關(guān)系，從而增加了TPHs 的生物可利用性，并提高了微生物的總呼吸速率，因此CMB 實驗方案的ORP 值高于CB 實驗方案。

2.3 土壤酶活性變化

圖4 為不同處理時期，不同處理條件下土壤中的脫氫酶、脂酶活性變化情況。從圖4-1 可以看出，在PS 氧化階段，殘留在土壤中的SO42-、Fe3+、Na+會干擾細胞的滲透平衡，導致脫氫酶活性降低。經(jīng)過24 d 的修復，脫氫酶活性觀測到顯著的峰值，CB 實驗方案的土壤中脫氫酶活性為2.66 μg/g，CMB 實驗方案的土壤中脫氫酶活性為2.94 μg/g。

修復時間延長，土壤中可供微生物利用的碳源逐步消耗，與此同時脫氫酶活性也出現(xiàn)下降趨勢。在土壤中，脂肪酶的活力也呈現(xiàn)出類似于脫氫酶的變化趨勢（如圖4-2 所示）。在48d 的修復過程中，CB 和CMB實驗方案中的脂肪酶活性最高，分別為195.4 μg/g，218.5 μg/g。結(jié)果表明，在中等或較低的氧化劑濃度下，酶活性被激活，當其活性達到最大值時，TPHs 降解效率提高。

3 結(jié)論

本實驗采用過硫酸鹽氧化（PS 氧化）和過硫酸鹽氧化-微生物（PS 微生物）修復兩種方案，對土壤理化性質(zhì)和酶活性的分析。

1）CB 和CMB 實驗方案中，TPHs 含量呈現(xiàn)快速下降趨勢；在60d 后，C10～C17 的脫除率達到了45.1%，OX2 中C10～C17 的脫除率達到了71.2%。另外，GZ6 功能菌可以增強其對TPHs 的降解效果。

2）CMB 處理后24 d 及48 d，脫氫酶及脂肪酶的活性達2.94、218.5 μg/g，與CB 處理后的脫氫酶及脂肪酶的活性2.69、196.5 μg/g 相比，分別增加了0.25、22.8 μg/g。通過預氧化作用，激活菌株中的脂類及脫氫酶，加速THPs 胞外酯基團的裂解，可以增強其溶解性，進而加快TPHs 的生物降解。