沙棘乙酸乙酯萃取物化學(xué)成分分析及體外抑制幽門螺桿菌機(jī)理研究

馬賀,雷梅英,王家娟,麻玉雯,王樹林

(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧,810016)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)是一種帶有鞭毛的革蘭氏陰性微需氧細(xì)菌,通常會(huì)感染胃黏膜上皮細(xì)胞,導(dǎo)致胃炎、胃癌和胃及十二指腸潰瘍[1]。報(bào)告稱,全球感染幽門螺桿菌的人口約44億,超過(guò)世界一半以上的人口[2]。隨著生活水平及醫(yī)療水平的提高,發(fā)達(dá)國(guó)家感染率逐漸下降,但發(fā)展中國(guó)家感染率依然很高。早期治療以抗生素為主,通常采用標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法(包含克拉霉素和甲硝唑或阿莫西林與質(zhì)子泵抑制劑的組合)。但是,由于抗生素的廣泛使用,標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法的療效急劇下降,根除率低至50%～70%[3]。幽門螺桿菌的抗生素耐藥性逐漸增強(qiáng),除此之外,抗生素還會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生副作用,增加治療成本。因此,人們積極尋找有效的抗幽門螺桿菌藥物,其中關(guān)于天然植物提取物抑制幽門螺旋桿菌的研究逐漸增多,其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)人體沒(méi)有副作用,且不會(huì)增加細(xì)菌耐藥性。

迄今為止,已發(fā)現(xiàn)的抗幽門螺桿菌植物有240余種。天然植物活性成分治療幽門螺旋桿菌感染已成為食品、藥學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。IBRAHIM等[4]使用羽穗草醇提物與連續(xù)萃取物(乙醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇)進(jìn)行抑制幽門螺桿菌活性實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醚萃取物抗幽門螺桿菌效果最好,其對(duì)臨床分離出75%的幽門螺桿菌具有抑制作用。此外,研究報(bào)道腺毛巖白菜根乙酸乙酯相提取物抗幽門螺桿菌效果優(yōu)于甲醇粗提物,可能是由于純化提高了活性成分的效力[5]。目前,已有多名學(xué)者從細(xì)胞水平上探究植物提取物對(duì)幽門螺桿菌的抑菌機(jī)制,如抗生物膜形成[6]、脲酶抑制[7]、增強(qiáng)細(xì)胞外膜通透性[8]、細(xì)菌結(jié)構(gòu)破壞[9]等。沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科、沙棘屬落葉灌木,其作為一種天然植物資源,廣泛分布在亞洲和歐洲,果實(shí)富含維生素C、黃酮類、有機(jī)酸、生育酚和其他酚類化合物[10],具有很高的藥用及食用價(jià)值,在中國(guó)民間常用于治療胃部疾病。沙棘提取物在抗動(dòng)脈粥樣化、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、保護(hù)心血管、保護(hù)皮膚以及保護(hù)胃腸道等方面都有重要作用[10]。而關(guān)于沙棘對(duì)幽門螺桿菌抑制作用的相關(guān)研究相對(duì)較少,早在2005年,LI等[11]研究發(fā)現(xiàn)沙棘葉乙醇提取物和水提物對(duì)幽門螺桿菌有抑制作用。2015年,MAMEDOV等[12]對(duì)沙棘果油和沙棘籽油進(jìn)行了抗幽門螺桿菌實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)沙棘油對(duì)幽門螺桿菌的抑制效果不明顯。最近,常應(yīng)九[13]發(fā)現(xiàn)沙棘果乙醇提取物對(duì)幽門螺桿菌具有較強(qiáng)的抑制活性,還發(fā)現(xiàn)沙棘果提取物通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制方式抑制脲酶活性,降低脲酶相關(guān)基因表達(dá)。而關(guān)于沙棘果提取物抑制幽門螺桿菌的化學(xué)成分以及細(xì)胞水平上的抑菌機(jī)制鮮有報(bào)道。

本文前期工作對(duì)沙棘果進(jìn)行乙醇超聲提取,得到乙醇粗提物后用有機(jī)溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)乙醇粗提物依次進(jìn)行液-液萃取,分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相組分,對(duì)4種萃取組分進(jìn)行抑制幽門螺桿菌活性測(cè)定,結(jié)果顯示,沙棘乙酸乙酯萃取物抑制幽門螺桿菌效果最好,其最小抑菌濃度為2.5 mg/mL,最小殺菌濃度為5 mg/mL。因此,本研究基于前期工作,利用高效液相色譜法測(cè)定了沙棘乙酸乙酯萃取物中的化學(xué)成分,并從膜結(jié)構(gòu)、脲酶活性以及細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)等方面深入探討其抑菌機(jī)制,為沙棘活性物質(zhì)抗幽門螺桿菌研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

野生沙棘(屬中國(guó)沙棘亞種)鮮果采摘于青海省海東市(海拔高度3 000～3 300 m,36.37°N,102.27°E);幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 43504),購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心,保存于青海大學(xué)實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱。

布氏肉湯培養(yǎng)基、1×PBS(pH 7.2～7.4)、尿素、KI,索萊寶生物科技有限公司;N-苯基-1萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,NPN)、戊二醛固定液,上海麥克林生化科技有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),天津富宇精細(xì)化工有限公司;EDTA,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;結(jié)晶紫、甲酚紅,上海展云化工有限公司;胎牛血清,浙江天杭生物科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜級(jí)),西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;磷酸,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;YM50立式壓力蒸汽滅菌器,上海三申醫(yī)療器械有限公司;Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo Fisher公司;JSM-7900F場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡,日本電子株式會(huì)社;LC-10 Avp 高效液相色譜,日本Shimadzu有限公司;THZ-103B恒溫培養(yǎng)搖床,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 沙棘乙酸乙酯萃取物制備

采用95%乙醇超聲提取,得到乙醇提取物浸膏,浸膏經(jīng)過(guò)石油醚萃取后,萃余相用乙酸乙酯萃取并將萃取物減壓濃縮,將萃取物放置在通風(fēng)櫥將溶劑揮干,得到乙酸乙酯萃取物,置于4 ℃冰箱備用。

1.4 幽門螺桿菌培養(yǎng)

將H.pylori菌種接種至含有6%胎牛血清(體積分?jǐn)?shù),下同)和少量抗生素的布氏肉湯培養(yǎng)基中[13],在37 ℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)2～3 d,使用微需氧產(chǎn)氣袋和2.5 L密閉培養(yǎng)盒達(dá)到所需微需氧環(huán)境。

1.5 沙棘乙酸乙酯萃取物抑菌機(jī)理的研究

1.5.1 對(duì)生物膜形成的影響

參考文獻(xiàn)[14]并稍做修改。將H.pylori培養(yǎng)48 h,用含6%胎牛血清布氏肉湯培養(yǎng)基稀釋菌液,使OD600值為0.15后加入96孔板中。在上述孔中加入不同質(zhì)量濃度(0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)乙酸乙酯萃取物,并以未加乙酸乙酯萃取物的處理組作對(duì)照。37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后,抽吸培養(yǎng)基,用PBS沖洗2次,37 ℃孵育10 min至干燥。將250 μL 0.1%結(jié)晶紫加入孔,染色反應(yīng)5 min后吸去結(jié)晶紫并用PBS洗滌2次,在37 ℃烘箱烘至干燥,加入洗脫劑無(wú)水乙醇于570 nm處測(cè)定吸光值,按公式(1)計(jì)算生物膜形成率:

(1)

式中:A樣品與A對(duì)照分別為沙棘乙酸乙酯萃取物處理組和對(duì)照組在570 nm處的吸光值。

1.5.2 細(xì)胞外膜滲透率的影響

采用NPN攝取法測(cè)定沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)幽門螺桿菌外膜的滲透能力[8]。將H.pylori培養(yǎng)48 h后,4 500 r/min離心10 min,并在PBS中洗滌2次后重懸于PBS,使其OD600=1.0±0.02。在菌懸液中加入不同質(zhì)量濃度(0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)的乙酸乙酯萃取物,以DMSO作為對(duì)照,在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,用PBS洗滌2次,在96孔板中加入菌液和40 μmol/L NPN后,在37 ℃孵育30 min后進(jìn)行熒光測(cè)量。熒光測(cè)量使用多功能酶標(biāo)儀,激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm,激發(fā)帶寬5 nm。所有測(cè)定均為3個(gè)重復(fù)。

1.5.3 細(xì)胞膜完整性的影響

參考TANG等[15]的方法,檢測(cè)胞質(zhì)成分(如DNA、RNA和蛋白質(zhì))的釋放來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。將培養(yǎng)48 h的H.pylori菌液,6 000 r/min離心10 min,用PBS洗滌2次后再次離心5 min,得到菌體。將菌體重懸到PBS中,使得OD600=1.0±0.02。將H.pylori菌懸液與乙酸乙醇提取物(0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)混合,在37 ℃下孵育12 h,離心取上清液。采用酶標(biāo)儀在260 nm和280 nm處測(cè)定吸光值,以DMSO作為對(duì)照,以PBS作為參比。

1.5.4 膜蛋白的影響

根據(jù)LI等[16]的方法稍作修改。將培養(yǎng)48 h的H.pylori菌液,在4 500 r/min離心10 min收集菌體,用PBS洗滌菌體2次,菌體重懸在PBS中,使其OD600=1.0±0.02。吸取200 μL菌液與50 μL不同濃度的0.9%生理鹽水配制的KI(0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mol/L)或乙酸乙醇提取物(0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)在25 ℃孵化1 h,以DMSO作為對(duì)照。在激發(fā)波長(zhǎng)(色氨酸)280 nm、(酪氨酸)296 nm處測(cè)定細(xì)菌的熒光發(fā)光值。

1.5.5 脲酶活性的影響

參考文獻(xiàn)[7]并稍做修改,將H.pylori培養(yǎng)48 h后,收集菌體,并用0.9%生理鹽水稀釋至OD600=1.00±0.02,將菌液與含有不同濃度的乙酸乙酯萃取物(0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)的培養(yǎng)基混合。在37 ℃培養(yǎng)2 h后,加入1.5 g/L尿素、1 g/L EDTA與0.2 g/L甲酚紅混合溶液,在37 ℃下孵育20 min。以DMSO作為對(duì)照。采用酶標(biāo)儀在590 nm處測(cè)定吸光值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.6 細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響

參考文獻(xiàn)[9]并稍做修改。用不同質(zhì)量濃度(0、2.5、5 mg/mL)乙酸乙酯萃取物處理OD600=0.5的細(xì)菌培養(yǎng)液。用5 mL乙酸乙酯萃取物與15 mL菌液在37 ℃孵育12 h,取5 mL菌液于10 mL離心管中,以4 500 r/min離心10 min,棄去上清液,加2.5%戊二醛溶液固定,渦旋振蕩5 min,在4 ℃冰箱黑暗處放置12 h,4 500 r/min離心5 min。棄去上清液加入1×PBS(pH 7.2～7.4)渦旋振蕩5 min,4 500 r/min離心10 min,棄去上清液,重復(fù)操作洗滌3次。離心后,用30%乙醇渦旋振蕩5 min,靜置5 min,4 500 r/min室溫離心5 min,棄去上清液。再依次使用50%、70%、80%、90%和100%乙醇進(jìn)行洗脫。將樣品放在載玻片上,進(jìn)行冷凍真空干燥,干燥后將樣品固定在樣品臺(tái)上,真空下濺射鍍金,然后用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察。

1.6 乙酸乙酯萃取物化學(xué)成分分析

采用配備waters 2996紫外檢測(cè)器的waters 2695型高效液相色譜儀測(cè)定乙酸乙酯萃取物的化學(xué)成分。根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]并稍做修改,測(cè)定乙酸乙酯萃取物中6種黃酮類物質(zhì),異鼠李素、槲皮素、山奈酚、兒茶素、沒(méi)食子酸和蘆丁。色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速1 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)280/360 nm,流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸,標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量10 μL,樣品進(jìn)樣量10 μL,沒(méi)食子酸和兒茶素在280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定;蘆丁、槲皮素、山奈酚和異鼠李素在360 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 六種黃酮類物質(zhì)的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of six flavonoids

蘋果酸測(cè)定根據(jù)王芮東等[18]的方法并稍做修改,色譜柱ODS(4.6 mm×250 mm,35 μm),流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm,流動(dòng)相甲醇-0.01 mol/L KH2PO4(3∶97,體積比)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.80),等度洗脫20 min。

通過(guò)對(duì)比樣品中不同化合物與異鼠李素、槲皮素、山奈酚、兒茶素、沒(méi)食子酸、蘆丁和蘋果酸等標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間,定性確定化合物種類。通過(guò)測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。化合物的含量以每g萃取物中含有的mg形式表示(即mg/g)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,使用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用Origin 2021進(jìn)行繪圖。處理組數(shù)據(jù)與對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),*、**、***分別表示處理組與對(duì)照組相比,在0.05、0.01、0.001水平上差異顯著,即P<0.05、P<0.01和P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)生物膜形成的影響

幽門螺桿菌分泌蛋白質(zhì)、多糖、胞外DNA和其他分子,在胃黏膜定居后產(chǎn)生胞外聚合物,這些聚合物被細(xì)菌包裹并黏附在一起形成生物膜。與浮游細(xì)菌相比,能形成生物膜的菌落對(duì)不利環(huán)境(如抗生素、高酸性)具有很高的抵抗力[19]。生物膜的存在使得幽門螺桿菌對(duì)抗生素的耐藥性增強(qiáng),因此減少生物膜合成可使幽門螺桿菌抵抗力減弱。如圖1所示,當(dāng)萃取物質(zhì)量濃度≥0.625 mg/mL時(shí),生物膜形成率與對(duì)照存在差異(P<0.01),說(shuō)明在此濃度時(shí),萃取物對(duì)生物膜的形成產(chǎn)生影響,降低了生物膜的形成。生物膜形成率隨著萃取物濃度的增加而降低,當(dāng)萃取物質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),生物膜形成率低至28.23%。

圖1 乙酸乙酯萃取物對(duì)生物膜形成的影響Fig.1 Inhibition of EA on biofilm formation

本結(jié)果表明,沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)幽門螺桿菌生物膜形成具有很強(qiáng)的抑制率,說(shuō)明沙棘乙酸乙酯萃取物通過(guò)抑制幽門螺桿菌生物膜的形成減弱其對(duì)外環(huán)境的抵抗力,更容易被殺死。此外,PRASAD等[6]觀察到菖蒲水提物能夠抑制幽門螺桿菌生物膜的形成。因此,破壞幽門螺桿菌生物膜的形成是一種抑制或殺死幽門螺桿菌的方式,沙棘乙酸乙酯萃取物還可以與抗生素一起使用,能更有效地抑制幽門螺桿菌。

2.2 沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)細(xì)胞外膜滲透率的影響

革蘭氏陰性菌由內(nèi)膜和外膜兩層膜包被,完整的外膜是滲透屏障。NPN在水環(huán)境中有微弱的熒光,但在非極性或疏水性環(huán)境中有強(qiáng)熒光[20]。外膜結(jié)構(gòu)一旦損壞,NPN可以進(jìn)入磷脂層,從而產(chǎn)生明顯的熒光現(xiàn)象。因此,幽門螺桿菌對(duì)NPN的攝取能力反應(yīng)了細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)及通透性的變化。

由圖2可見(jiàn),乙酸乙酯萃取物處理后,細(xì)胞內(nèi)NPN的熒光強(qiáng)度持續(xù)增加。0.625～5 mg/mL樣品處理組熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(P<0.01),說(shuō)明經(jīng)過(guò)萃取物處理后,幽門螺桿菌外膜通透性增強(qiáng)。與對(duì)照組相比,高劑量組(5 mg/mL處理組)NPN攝取率提高2.45倍,說(shuō)明乙酸乙酯萃取物在殺菌濃度下破壞了細(xì)菌膜,細(xì)胞外膜通透性明顯增加。此結(jié)果與ZHOU等[8]發(fā)現(xiàn)HF-18肽能夠增加幽門螺桿菌外膜通透性的研究結(jié)果類似,都是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞外膜通透性,進(jìn)而影響幽門螺桿菌的生長(zhǎng)。

圖2 不同質(zhì)量濃度乙酸乙酯萃取物對(duì)幽門螺桿菌 細(xì)胞外膜的影響Fig.2 Effect of different concentrations of EA on the outer cell membrane of H. pylori

2.3 沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜的完整性是細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。蛋白質(zhì)和核酸是存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的生物大分子,蛋白質(zhì)主要提供結(jié)構(gòu)功能,而核酸攜帶大量的遺傳信息。細(xì)胞滲漏的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括細(xì)胞內(nèi)容物核酸在260 nm處的吸光度和蛋白質(zhì)在280 nm處的吸光度,可以作為評(píng)價(jià)膜完整性的指標(biāo)[15]。

從圖3可知,萃取物質(zhì)量濃度為0.625 mg/mL時(shí),核酸雖有泄露,但與對(duì)照比,差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明在此濃度的萃取物對(duì)核酸泄露的影響不顯著。與對(duì)照比,在2.5 mg/mL時(shí),核酸泄露嚴(yán)重(P<0.05)。在5 mg/mL時(shí),核酸泄露極其嚴(yán)重(P<0.05),是對(duì)照的3.28倍。隨著萃取物濃度的增加,蛋白質(zhì)泄露逐漸增加。與對(duì)照比,在

a-細(xì)胞內(nèi)核酸泄露測(cè)定;b-細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄露測(cè)定

0.625 mg/mL時(shí),蛋白質(zhì)雖有泄露,但差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明蛋白質(zhì)泄露不明顯。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí),蛋白質(zhì)泄露率達(dá)到45.15%。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),蛋白質(zhì)泄露最為嚴(yán)重,泄露率高達(dá)98.72%。總之,當(dāng)乙酸乙酯萃取物質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí),細(xì)胞內(nèi)容物泄露嚴(yán)重,這可能是因?yàn)榧?xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞甚至細(xì)胞裂解死亡。此結(jié)果與TANG等[15]發(fā)現(xiàn)黑胡椒提取物破壞李斯特菌和沙門氏菌細(xì)胞膜完整性的結(jié)果類似。

2.4 沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)膜蛋白的影響

沙棘乙酸乙酯萃取物可以使細(xì)胞外膜通透性增加及細(xì)胞膜受損,研究某些特定蛋白質(zhì)的在膜中的位置可以進(jìn)一步解釋細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變。色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等氨基酸殘基是膜蛋白中主要的熒光載體。KI是一種熒光猝滅劑,可以猝滅膜蛋白表面殘基的熒光,但對(duì)位于膜蛋白內(nèi)部或縫隙中殘基的熒光光譜不產(chǎn)生影響[21]。因此,測(cè)定Trp和Tyr熒光光譜的變化可以定性地確定兩種氨基酸在膜中的位置。

如圖4-a和圖4-b所示,隨著KI含量的增加,Trp和Tyr殘基沒(méi)有明顯的猝滅作用,表明Trp和Tyr殘基主要位于膜內(nèi),結(jié)果與WU等[21]研究結(jié)果一致。

隨著萃取物濃度增加,Trp和Tyr殘基的最大發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低(圖4-c和圖4-d),這表明沙棘乙酸乙酯萃取物與膜蛋白發(fā)生了相互作用,改變了膜蛋白的結(jié)構(gòu),使Trp、Tyr的位置從細(xì)胞膜內(nèi)到細(xì)胞膜外,將殘基暴露出來(lái),從而使更多的沙棘乙酸乙酯萃取物能夠與Trp和Tyr接觸并猝滅其熒光。根據(jù)本研究結(jié)果,沙棘乙酸乙酯萃取物可能通過(guò)與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)相互作用而改變膜蛋白的構(gòu)象,進(jìn)而影響細(xì)胞膜的通透性。

a-不同濃度KI對(duì)色氨酸熒光光譜的影響;b-不同濃度KI對(duì)酪氨酸熒光光譜的影響;c-不同濃度沙棘乙酸乙酯萃取 相對(duì)色氨酸熒光光譜的影響;d-不同濃度沙棘乙酸乙酯萃取相酪氨酸熒光光譜的影響

2.5 沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)脲酶活性的影響

脲酶是幽門螺桿菌在胃內(nèi)成功定植的關(guān)鍵因素之一,在高酸環(huán)境下,幽門螺桿菌可以產(chǎn)生大量脲酶[22]。脲酶可以將尿素分解為氨,氨能中和胃酸,創(chuàng)造出適合幽門螺桿菌生長(zhǎng)的環(huán)境。因此,通過(guò)抑制脲酶的活性可以達(dá)到抑制幽門螺桿菌生長(zhǎng)的目的。由圖5可見(jiàn),幽門螺桿菌脲酶活性與乙酸乙酯萃取物劑量之間呈現(xiàn)劑量依賴遞減,在0.625～5 mg/mL時(shí)脲酶活性與對(duì)照相比,脲酶活性極顯著降低(P<0.01)。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)脲酶活性降低了

圖5 沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)幽門螺桿菌脲酶活性的影響Fig.5 Effect of EA on the urease activity of H. pylori

87.89%。結(jié)果表明,沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)幽門螺桿菌脲酶活性具有明顯的抑制作用。此結(jié)果與常應(yīng)九[13]報(bào)道的沙棘水提物抑制脲酶活性的結(jié)果相一致。LEE等[7]研究表明來(lái)檬提取物通過(guò)降低脲酶活性能夠抑制幽門螺桿菌的生長(zhǎng)繁殖。

2.6 沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)幽門螺桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

如圖6-a所示,對(duì)照組幽門螺桿菌細(xì)胞呈桿狀,邊界清晰,表面光滑。經(jīng)2.5 mg/mL的沙棘乙酸乙酯萃取物處理12 h后,細(xì)胞表面粗糙,細(xì)胞表現(xiàn)為畸形,出現(xiàn)褶皺(圖6-b)。5 mg/mL沙棘乙酸乙酯萃取物處理12 h后,細(xì)胞形態(tài)被破壞,部分細(xì)胞呈球狀,部分細(xì)胞裂解,細(xì)胞表面黏附顆粒(圖6-c)。這一結(jié)果說(shuō)明沙棘乙酸乙酯萃取物可以抑制幽門螺桿菌生長(zhǎng),改變細(xì)胞形態(tài),破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此結(jié)果與YANG等[9]報(bào)道的山奈酚破壞細(xì)胞形態(tài)結(jié)果表現(xiàn)一致,也從另一個(gè)方面驗(yàn)證了沙棘乙酸乙酯萃取物可以改變膜結(jié)構(gòu)。

a-對(duì)照組;b-2.5 mg/mL樣品處理組;c-5 mg/mL樣品處理組

2.7 沙棘乙酸乙酯萃取物化學(xué)成分

由表2結(jié)果可知,沙棘乙酸乙酯萃取物中不含有兒茶素,其他5種黃酮類物質(zhì)都存在于沙棘乙酸乙酯萃取物中,其中蘆丁和異鼠李素含量較高。現(xiàn)有研究表明蘆丁[23]、異鼠李素[24]、槲皮素[25]和山奈酚[26]均能抑制幽門螺桿菌生長(zhǎng),其最小抑菌濃度分別為600、3.9、128、14.312 μg/mL。沒(méi)食子酸含量在乙酸乙酯萃取物占比較低,但其也具有抗幽門螺桿菌的能力[27]。從表2中可以看出,蘋果酸的含量最高,同時(shí)蘋果酸也具有抑制幽門螺桿菌的能力。

表2 沙棘乙酸乙酯萃取物中黃酮類物質(zhì)和蘋果酸的化學(xué)物質(zhì)含量Table 2 Content of flavonoids and malic acid in EA

從圖7-c中可以觀察到,在保留時(shí)間為29.27 min時(shí),出現(xiàn)最高峰,其化學(xué)結(jié)構(gòu)未得到鑒定,將其定義為未鑒定的化合物,這種未鑒定的化合物也可能具有抑制幽門螺桿菌的效果。

a-6種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖;b-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖;c-沙棘乙酸乙酯萃取物中黃酮類物質(zhì)色譜圖;d-沙棘乙酸乙酯萃取物中蘋果酸色譜圖

3 結(jié)論

綜上所述,沙棘乙酸乙酯萃取物通過(guò)破壞幽門螺桿菌生物膜、改變膜結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)、增加細(xì)胞外膜及內(nèi)膜的通透性、改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)和降低脲酶活性抑制幽門螺桿菌生長(zhǎng)。沙棘乙酸乙酯萃取物中的化學(xué)成分主要是蘋果酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚和異鼠李素,已有研究報(bào)道這些物質(zhì)均具有抗幽門螺桿菌活性。但關(guān)于沙棘乙酸乙酯萃取物對(duì)幽門螺旋桿菌的抑制效果是單一物質(zhì)的高抑菌效果,還是這些物質(zhì)的協(xié)同作用,需要進(jìn)一步深入研究。