SOCS3調控JAK/STAT3通路對PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟毒性的影響*

符基定 曾麗斯 林頡 韋伊爾 徐維 徐睿 冼樂武

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院1.重癥醫學科;2.腫瘤研究所;3.放療科;4.胸外科;5.腫瘤內科,廣東 廣州 510095)

程序性死亡受體1/程序性死亡配體1(Programmed cell death 1/Programmed cell death-ligand 1,PD-1/PD-L1)免疫檢查點抑制劑通過阻斷PD-1/PD-L1靶向免疫細胞通路,從而抑制腫瘤細胞免疫逃逸,其已被應用于各種類型的癌癥治療[1-2]。但PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑對心血管系統有著明顯影響,可產生心臟驟停、心源性休克和完全性房室傳導阻滯等嚴重后果,且炎性反應介導的心臟毒性可涉及心臟的任何部分[3]。已有研究發現PD-1/PD-L1抑制劑可將心臟巨噬細胞極化為M1樣表型而誘導心臟損傷[4]。細胞因子信號轉導抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3)是細胞因子信號轉導負調控因子,其在巨噬細胞極化中發揮的重要作用,已有研究發現脂多糖(Lipolyaccharide, LPS)促進大鼠巨噬細胞M1型極化,并顯著升高SOCS3的表達進而促進巨噬細胞炎癥反應[5-6]。另外,研究發現SOCS3是蛋白酪氨酸激酶/信號轉導子與轉錄激活子3(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3,JAK/STAT3)通路的負調控因子,其直接抑制JAK激酶的活性,進而抑制STAT3的激活,這一現象對克服過度的組織炎癥和防止炎癥免疫反應期間的組織損傷有重要意義[7-8]。因此,本研究旨在探討SOCS3調控JAK/STAT3信號通路對巨噬細胞極化的作用機制,以及其在PD-1/PD-L1抑制劑誘導的小鼠心臟毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只SPF級6周齡BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號:SCXK(X)2016-0011],體重(21.0±4.5)g。所有小鼠適應性喂養一周,喂養在18～22 ℃,12 h/12 h明暗交替動物房中,自由飲水喂食。本研究已獲得本院實驗動物倫理委員會批準(批準號:WDKQSPF/SQ-03)。

1.2 主要實驗材料與試劑 小鼠巨噬細胞RAW 264.7購自中國科學院上海細胞庫。BMS-1(PD-1/PD-L1 抑制劑,純度99.56%,HY-19991)、AG490(JAK/STAT3通路抑制劑,純度99.97%,HY-12000)、LPS(HY-D1056)購自美國(MedChemExpress)MCE公司;pc-SOCS3和對照物、si- SOCS3和對照物購自廣州銳博生物科技有限公司;Lipofectamine?3000 Transfection Reagentt轉染試劑(L3000-015)購自美國Invitrogen公司;流式細胞術抗體CD86(70-AM08605-50)、CD80(70-AM08005-50)購自杭州聯科生物技術股份有限公司;小鼠IL-10(E-EL-M0046c)、TNF-α(E-EL-M3063)和IL-1β(E-EL-M0037c)購自武漢伊萊瑞特公司;抗體SOCS3(ab16030)、CD86(ab220188)、CD80(ab238481)、p-JAK1(ab138005)、JAK1(ab133666)、p-JAK2(ab32101)、JAK2(ab108596)、p-STAT3(ab76315)、STAT3(ab68153)、GAPDH(ab8245)、辣根過氧化物酶標記的二抗(ab288151)購自英國abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞轉染和分組 RAW 264.7細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中,在37 ℃含5% CO2培養箱中培養。細胞傳3代后,將所有細胞分為對照組(正常培養)、LPS組[9](LPS 100 ng/mL)、pc-NC組[轉染pc-NC(pc-SOCS3對照物)+LPS 100 ng/mL]、pc-SOCS3組(轉染pc-SOCS3+LPS 100 ng/mL,使細胞過表達SOCS3)、si-NC組[轉染si-NC(si-SOCS3對照物)+LPS 100 ng/mL]、si-SOCS3組(轉染si-SOCS3+LPS 100 ng/mL,使細胞低表達SOCS3)、抑制劑組[10](轉染si-SOCS3+LPS 100 ng/mL+ JAK/STAT3通路抑制劑AG490 10 μmol/L)。LPS組使用100 ng/mL LPS直接處理細胞24 h,除對照組和LPS組外,各轉染組通過Lipofectamine3000試劑分別轉染pc-SOCS3和對照物、si-SOCS3和對照物至RAW264.7細胞中,然后使用100 ng/mL LPS處理24 h,抑制劑組細胞轉染si-SOCS3后,100 ng/mL LPS和10 μmol/L JAK/STAT3通路抑制劑AG490共處理24 h。

1.3.2 動物造模與分組 所有BALB/c小鼠分為正常組、模型組[6](PD-1/PD-L1抑制劑BMS-1 10 mg/kg)、si-NC組(10 mg/kg BMS-1+si-NC)、si-SOCS3組(10 mg/kg BMS-1+ si-SOCS3)、抑制劑組[11](10 mg/kg BMS-1+ si-SOCS3+5mg/kg AG490),每組10只。除正常組外,其余各組小鼠每2天腹腔注射10 mg/kg BMS-1,共注射6次,建立PD-1/PD-L1抑制劑誘導的小鼠心臟毒性模型,40只小鼠均造模成功。造模結束后,si-NC組尾靜脈注射200 μL si-NC,SOCS3組和抑制劑組尾靜脈注射200 μL si-NC和si-SOCS3,濃度均為50 μmol/L,每只小鼠每次注射劑量均為10 nmol,其余小鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。另外,抑制劑組在尾靜脈注射si-SOCS3的同時腹腔注射5 mg/kg AG490,其余各組腹腔注射相應劑量生理鹽水,所有小鼠連續干預2周,每周3次。最后一次治療結束24 h后,小鼠稱重后麻醉,1 mL一次性無菌注射器自心尖處取血,離心后將血清凍存在-80 ℃備用,然后取出小鼠心臟組織,準確稱重后計算心臟指數,各組隨機取5只小鼠心臟組織固定在4%多聚甲醛中,另5只凍存在-80 ℃冰箱中。

1.3.3 HE染色觀察小鼠心臟組織病理 取出固定在多聚甲醛中的各組小鼠心臟組織,經乙醇脫水后使用石蠟包埋并切成5 μm切片,經脫蠟脫水后使用HE染色。光學顯微鏡評估心臟組織病理。

1.3.4 ELISA法檢測細胞上清和小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β水平 各組細胞上清和小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β水平通過ELISA試劑盒檢測,具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 Western blot檢測細胞和小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80、JAK/STAT3通路相關蛋白 提取各組細胞和凍存的小鼠心臟組織總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。使用SDS-PAGE分離蛋白質樣品,然后轉移到PVDF膜上,將其與一抗SOCS3、CD86、CD80、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、GAPDH在4 ℃下孵育過夜,然后用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h,使用ECL試劑顯影,Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行量化。

2 結果

2.1 SOCS3對RAW264.7細胞SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達 與對照組相比,LPS組細胞SOCS3、CD86、CD80 蛋白表達明顯升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達明顯降低(P<0.05);與LPS組和pc-NC組相比,pc-SOCS3組細胞SOCS3、CD86、CD80蛋白表達明顯升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達明顯降低(P<0.05);與LPS組和si-NC組相比,si-SOCS3組細胞SOCS3、CD86、CD80蛋白表達明顯降低,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達明顯升高(P<0.05);與si-SOCS3組相比,抑制劑組細胞CD86、CD80蛋白表達明顯升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達明顯降低(P<0.05),見圖1、表1。

表1 SOCS3對RAW264.7細胞SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達

圖1 SOCS3對RAW264.7細胞SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達

2.2 SOCS3對RAW264.7細胞上清TNF-α、IL-1β、IL-10的影響 與對照組相比,LPS組細胞上清TNF-α、IL-1β水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05);與LPS組和pc-NC組相比,pc-SOCS3組細胞上清TNF-α、IL-1β水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05);與LPS組和si-NC組相比,si-SOCS3組細胞上清TNF-α、IL-1β水平明顯降低,IL-10水平明顯升高(P<0.05);與si-SOCS3組相比,抑制劑組細胞上清TNF-α、IL-1β水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05),見表2。

表2 SOCS3對RAW264.7細胞上清TNF-α、IL-1β、IL-10的影響

2.3 SOCS3對PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟指數和病理的影響 與正常組相比,模型組小鼠心臟指數明顯升高(P<0.05);與模型組和si-NC組相比,si-SOCS3組小鼠心臟指數明顯降低(P<0.05);與si-SOCS3組相比,抑制劑組小鼠心臟指數明顯升高(P<0.05)(表3)。HE染色結果顯示,正常組小鼠心臟組織結構正常,心肌細胞排列整齊;模型組和si-NC組小鼠心臟組織紋理不清晰,結構紊亂,伴有炎性浸潤;si-SOCS3組小鼠心臟組織損傷較模型組和si-NC組有所減輕,抑制劑組加重了小鼠心臟損傷,見圖2。

表3 SOCS3對PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟指數的影響

圖2 小鼠心臟HE染色(200×)

2.4 SOCS3對PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β的影響 與正常組相比,模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05);與模型組和si-NC組相比,si-SOCS3組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯降低,IL-10水平明顯升高(P<0.05);與si-SOCS3組相比,抑制劑組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平明顯升高,IL-10水平明顯降低(P<0.05),見表4。

表4 SOCS3對PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠血清IL-10、TNF-α和IL-1β的影響

2.5 SOCS3對PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達 與正常組相比,模型組小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80蛋白表達明顯升高,p-JAK1、p-JAK2、p-

STAT3蛋白表達明顯降低(P<0.05);與模型組和si-NC組相比,si-SOCS3組小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80蛋白表達明顯降低,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達明顯升高(P<0.05);與si-SOCS3組相比,抑制劑組小鼠心臟組織CD86、CD80表達明顯升高,p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達明顯降低(P<0.05),見圖3、表5。

表5 SOCS3對PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達

圖3 SOCS3對PD-1/PD-L1抑制劑所致小鼠心臟組織SOCS3、CD86、CD80以及JAK/STAT3通路蛋白表達

3 討論

巨噬細胞參與了自身免疫和炎癥性疾病,在宿主防御和維持內部環境穩定方面發揮極其重要的作用[12]。一般認為LPS會誘導巨噬細胞M1型極化,M1型巨噬細胞通過分泌大量的炎癥因子,如IL-1β、TNF-α參與身體的炎癥反應[13]。作為SOCS家族的重要分子,大量研究表明SOCS3可被多種炎癥因子和抗炎因子誘導表達,并抑制多種免疫分子的信號傳導,其也是巨噬細胞功能的重要調節因子[14]。已有研究發現SOCS3可促進巨噬細胞極化為M1型[15]。本研究結果發現LPS誘導巨噬細胞后,SOCS3表達明顯升高,并且刺激細胞分泌IL-1β、TNF-α促炎因子,抗炎因子IL-10分泌減少,M1型巨噬細胞標志物CD86和CD80表達明顯升高,過表達SOCS3后,巨噬細胞M1型極化和炎癥反應進一步增加,低表達SOCS3抑制了巨噬細胞M1型極化和炎癥反應,表明LPS成功誘導了巨噬細胞M1型極化,SOCS3參與巨噬細胞M1型極化。

SOCS3通過抑制STAT3的磷酸化及其二聚體的形成或者直接抑制JAK的磷酸化負向調節JAK-STAT3 信號通路,在免疫炎癥反應中起關鍵作用[5]。Chi等[16]研究發現敲低SOCS3的表達,明顯激活JAK2/STAT3信號通路并抑制巨噬細胞M1極化。另外,Geng等[17]研究發現,LPS刺激后,SOCS3需達到一定水平后,才可抑制JAK/STAT信號通路。本研究結果顯示,LPS明顯促進SOCS3的表達,而抑制JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表達,低表達SOCS3后,JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表達明顯升高,并明顯抑制巨噬細胞M1型極化,使用JAK/STAT3通路抑制劑后,逆轉了SOCS3低表達對巨噬細胞M1型極化和炎癥反應的的抑制作用,與Chi等[16]結果基本一致,表明低表達SOCS3可通過激活JAK/STAT3通路抑制巨噬細胞M1型極化。

PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑已在抗腫瘤治療中取得了巨大的成功,但其會誘發廣泛的免疫相關不良事件,其中心臟毒性是最致命的不良反應[18-19]。PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制劑誘發的心臟毒性中炎癥因子風暴會引發強自由基反應,進而破壞心臟屏障,加重心臟損傷[20-21]。已有研究發現PD-1/PD-L1治療后引起的炎癥因子風暴會使巨噬細胞向M1型極化進而分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子促進炎癥反應[22]。Chen等[23]研究發現PD-1/PD-L1抑制劑可促進巨噬細胞M1型極化,并通過增加小鼠炎癥反應誘導黑色素瘤小鼠心肌細胞凋亡和心臟毒性。本研究結果顯示,PD-1/PD-L1抑制劑明顯誘導小鼠心臟毒性,小鼠血清TNF-α、IL-1β水平、心臟組織SOCS3、CD86、CD80蛋白表達明顯升高,小鼠血清IL-10水平顯著降低;抑制SOCS3表達后,明顯減輕小鼠心臟毒性,小鼠血清TNF-α、IL-1β水平、心臟組織SOCS3、CD86、CD80蛋白表達明顯降低,小鼠血清IL-10水平明顯升高,表明SOCS3參與調控PD-1/PD-L1抑制劑誘導的小鼠心臟毒性,低表達SOCS3可抑制小鼠巨噬細胞M1型極化并抑制小鼠炎癥反應。另外,經PD-1/PD-L1抑制劑誘導后,小鼠心臟組織JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表達明顯降低,低表達SOCS3小鼠心臟組織JAK1、JAK2以及STAT3磷酸化表達明顯升高,JAK/STAT3抑制劑逆轉了低表達SOCS3對小鼠心臟組織毒性的減輕作用以及炎癥抑制作用,表明抑制SOCS3表達可通過激活JAK/STAT3信號通路減輕PD-1/PD-L1抑制劑對小鼠的心臟毒性,為臨床PD-1/PD-L1抑制劑誘導的心臟毒性損傷修復提供新的治療靶點。

4 結論

在PD-1/PD-L1抑制劑誘導小鼠心臟毒性和巨噬細胞M1型極化中,SOCS3的表達明顯升高,抑制SOCS3的表達可通過激活JAK/STAT3信號通路,減輕PD-1/PD-L1抑制劑誘導小鼠心臟毒性,并抑制巨噬細胞M1性極化,表明SOCS3可作為PD-1/PD-L1抑制劑誘導的心臟毒性損傷的新的治療靶點,為臨床治療PD-1/PD-L1抑制劑誘導的心臟損傷提供理論依據。