槐耳多糖調節YAP/TAZ信號通路對骨肉瘤細胞生物學行為的影響

陳嘉麗 韓夢媛 王冬明

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院藥劑科,上海 200032)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一種被認為來源于骨形成間充質干細胞的罕見腫瘤[1],主要影響青少年,雖然僅占兒童和青少年癌癥約5%,但它對兒童癌癥死亡率有很大影響[2-4]。一小部分低級別OS可通過手術治愈[5],但當OS發生轉移時,單獨手術無法治愈[6]。因此,研究OS的發生機制仍是一個挑戰。槐耳具有廣泛的抗癌功能,包括誘導細胞凋亡、抑制血管生成和刺激免疫系統,且未發現明顯的副作用[7-8]。槐耳多糖(Sophora japonica polysaccharide,PST)是從槐耳中提取的活性成分,由6種單糖和18種氨基酸組成。研究發現,PST可以抑制三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)細胞的增殖和遷移[9]。Qi等[10]發現PST誘導胃癌細胞凋亡。Li等[11]發現PST可以在乳腺癌治療中起到積極作用。但是目前關于PST是否對OS起到積極影響鮮有報道。Yes相關蛋白(YAP)/轉錄共激活因子PDZ結合基序(TAZ)信號軸在許多實體瘤的生長和進展過程中經常被激活,包括肺癌、結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤和膠質瘤,YAP/TAZ信號通路激活可以驅動癌細胞存活、增殖、侵襲、遷移和轉移[12]。YAP/TAZ信號通路的激活也可能使化療、放療或免疫治療產生耐藥性[13]。也有研究發現YAP/TAZ通路可以作為治療轉移性癌癥的靶標[14]。Kovar等[15]發現,YAP/TAZ在腫瘤發生和轉移中起重要作用。而槐耳可以通過下調肝細胞癌中的YAP來增強奧沙利鉑的化療敏感性[16]。基于此,本研究探討PST是否可能通過下調YAP/TAZ信號通路對OS細胞生物學行為產生影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要材料 PST(貨號:FT28138-5g)購自上海梵態生物科技有限公司;人OS細胞MG63(貨號:YS4270C)、Saos-2(貨號:YS4116C)、G292(貨號:YS3740C)、U20S(貨號:YS962C)購自上海雅吉生物科技有限公司;人成骨細胞hFOB 1.19(貨號:Sci-H1092)購自上海圻明生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(貨號:PH1759)購自福州飛凈生物科技有限公司;抗體:p-YAP(貨號:ab76252)、YAP(貨號:ab205270)、TAZ(貨號:ab242313)、Bcl-2(貨號:ab117115)、Bax(貨號:ab81083)、cleaved-Caspase-3(貨號:ab208003)、E-cadherin(貨號:ab76319)、vimentin(貨號:ab217673)、N-cadherin(貨號:ab271856)購自Abcam公司。

1.2 細胞培養及分組 將所有細胞均用補充有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基培養,培養基置于37 ℃,5% CO2的培養箱中。待G292細胞生長匯合度達到70%時,分為以下6組:G292組(G292細胞未做任何處理);用1、2.5、5 μg/mL PST[17]處理G292細胞依次記為L-PST組、M-PST組、H-PST組,用10 μmol/L YAP/TAZ信號通路激活劑GA-017[18]處理G292細胞記為GA-017組,用5 μg/mL PST和10 μmol/L GA-017共同處理G292細胞記為H-PST+GA-017組。轉染后繼續培養48 h,用于后續實驗。

1.3 CCK-8檢測G292細胞活性 將細胞接種在96孔板上,每孔接種3 000個細胞進行相應處理,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養48 h后添加10 μL CCK-8試劑,最后用酶標儀檢測吸光度值(A450)。

1.4 流式細胞術檢測G292細胞凋亡 將各組細胞進行胰酶消化,以250×g離心5 min,用預冷的PBS洗滌兩次,每次10 min,然后轉移到流式管中。用500 μL結合緩沖液重懸細胞,加入5 μL AnnexinV-FITC和PI,室溫下孵育10 min,上機檢測細胞凋亡率。

1.5 劃痕實驗以及Transwell法檢測G292細胞遷移和侵襲 ①遷移:將細胞密度調整為2×105個/mL。取1 mL細胞懸液加入6孔板中。在細胞生長覆蓋板底部后,使用無菌移液槍槍頭小心地刮擦板底部,并用PBS沖洗。在細胞培養24 h后用顯微鏡拍照并計算遷移率。遷移率(%)=(初始劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。②侵襲:預先將Matrige鋪在Transwell上室,向Transwell上室加入200 μL濃度為2×105個/mL的細胞懸液。在下室加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基,并在孵育24 h后取出Transwell的上室。小心地去除未穿膜的G292細胞,用4%多聚甲醛將G292細胞固定,并用0.01%結晶紫染色約10 min。隨后,在光學顯微鏡下觀察G292細胞侵襲數量。

1.6 Western blot檢測YAP/TAZ通路蛋白、EMT相關蛋白以及凋亡相關蛋白表達 將G292細胞加入裂解液后,在冰上裂解30 min,將細胞經4 ℃離心機離心后獲得上清液,上清液用于總蛋白提取。使用BCA法定量總蛋白,隨后將蛋白質在制備的凝膠上運行以進行分離。分離后,將蛋白質轉移到PVDF膜上,該膜與一抗(p-YAP、YAP、TAZ、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、E-cadherin、vimentin、N-cadherin、GAPDH)在4 ℃下孵育過夜,TBST洗膜后,加入標記的二抗孵育1 h,ECL顯色劑顯色后用ImageJ軟件對蛋白質定量。

2 結果

2.1 PST對細胞活性的影響 PST(2.5～5 μg/mL)抑制MG63、Saos-2、U20S、G292細胞A450值(P<0.05),且對G292細胞影響最顯著。因此,以G292細胞為研究對象。見表1。

表1 PST對細胞A450值的影響

2.2 PST對各組G292細胞活性的影響 與G292組相比,M-PST組、H-PST組G292細胞A450值顯著減小(P<0.05),GA-017組顯著增加(P<0.05);與H-PST組相比,H-PST+GA-017組A450值顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 PST對G292細胞活性的影響

2.3 PST對G292細胞凋亡的影響 與G292組相比,M-PST組、H-PST組細胞凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平顯著下降(P<0.05),GA-017組呈相反趨勢(P<0.05);與H-PST組相比,H-PST+GA-017組細胞凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著下降(P<0.05),Bcl-2蛋白水平顯著上升(P<0.05)。見圖1～2、表3。

圖1 流式細胞術檢測G292細胞凋亡率

圖2 各組G292細胞凋亡蛋白比較

表3 各組G292細胞凋亡率及凋亡相關蛋白的比較

2.4 PST對G292細胞遷移、侵襲以及EMT相關蛋白的影響 與G292組相比,M-PST組、H-PST組G292細胞遷移率、侵襲數量以及vimentin、N-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白水平呈顯著上調趨勢(P<0.05),而GA-017組E-cadherin蛋白水平顯著減少(P<0.05),遷移率、侵襲數量以及vimentin、N-cadherin蛋白水平顯著上升(P<0.05);H-PST+GA-017組較H-PST組G292細胞遷移率、侵襲數目、vimentin、N-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白水平顯著下降(P<0.05)。見圖3～5、表4～5。

圖3 劃痕試驗觀察G292細胞遷移(40×)

圖4 Transwell試驗觀察G292細胞侵襲(200×)

圖5 各組G292細胞EMT相關蛋白的比較

表4 PST對G292細胞遷移、侵襲的影響

表5 PST對G292細胞EMT相關蛋白的影響

2.5 PST對G292細胞YAP/TAZ通路蛋白的影響 與G292組相比,M-PST組、H-PST組G292細胞p-YAP/YAP、TAZ蛋白水平顯著下降(P<0.05),而GA-017組p-YAP/YAP、TAZ蛋白水平顯著上升(P<0.05);H-PST+GA-017組較H-PST組p-YAP/YAP、TAZ蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖6、表6。

圖6 各組G292細胞YAP/TAZ通路蛋白水平

表6 各組G292細胞YAP/TAZ通路蛋白水平比較

3 討論

OS是最常見的原發性骨惡性腫瘤,具有很高的局部浸潤和轉移傾向。盡管手術與化療相結合極大地改善了OS患者的預后,但轉移性或復發性OS的預后仍然效果不佳[19]。因此,研究OS的發生機制仍是臨床面臨的難題之一。越來越多的證據表明,中藥具有抑制腫瘤生長的潛力[16]。槐耳已被用于多種癌癥的治療,而PST作為槐耳中的主要活性成分在癌癥治療中也被廣泛研究,大量研究證實PST在TNBC[9]、肝癌[20]、乳腺癌[11]的治療中起到積極作用,但PST在OS上的研究鮮有報道。本研究結果顯示,PST抑制OS細胞系(MG63、Saos-2、U20S、G292)細胞活性,且對G292細胞效果最顯著,因此,以G292細胞為研究對象。與G292組相比,M-PST組、H-PST組G292細胞A450值、Bcl-2蛋白水平顯著下降,細胞凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著升高,提示PST可能通過抑制G292細胞增殖,促進其凋亡抑制OS發展。

上皮間質轉化(EMT)已被確定在腫瘤進展,侵襲和轉移中起關鍵作用,并且是癌細胞獲得侵襲性的一種方式[21]。在EMT過程中,上皮細胞通過失去細胞極性和上皮標志物(E-cadherin)的表達而經歷表型轉換,通過獲得間充質標志物(N-cadherin,vimentin)表達而成為間充質細胞[22]。因此,這些轉化的上皮細胞獲得成纖維細胞樣特性,并表現出細胞間粘附減少和運動性增加[23-24]。本研究結果顯示,與G292組相比,M-PST組、H-PST組G292細胞遷移率、侵襲數量以及vimentin、N-cadherin蛋白水平均顯著下降,E-cadherin蛋白水平顯著升高,提示PST可能通過抑制G292細胞EMT過程抑制OS的進展。

國外研究報道稱YAP/TAZ信號通路激活是腫瘤生長、轉移和耐藥性的驅動因素[12]。大量研究也證實可以通過調控YAP/TAZ信號通路來抑制癌癥的發展。例如Zhu等[25]發現激活YAP/TAZ通路促進肝細胞癌的增殖。Ma等[26]發現激活YAP/TAZ信號通路促進結直腸腫瘤的發生。而YAP/TAZ信號通路在OS中的研究已經非常普遍,研究發現YAP/TAZ信號軸協調人OS的去分化、細胞命運和轉移[27]。Ferraiuolo等[28]還發現龍舌蘭可以通過抑制YAP/TAZ信號通路抑制細胞活力、集落形成和細胞遷移,并且可以誘導OS細胞系的凋亡,本研究結果與其一致。在本研究中,PST處理后G292細胞p-YAP/YAP、TAZ蛋白水平顯著降低,提示PST可能通過抑制YAP/TAZ信號通路發揮抑制OS發展的作用。為了進一步證實猜測,本研究用YAP/TAZ信號通路激活劑GA-017處理G292細胞,結果發現GA-017組G292細胞A450值、遷移率、侵襲數量以及vimentin、N-cadherin、Bcl-2、p-YAP/YAP、TAZ蛋白水平均顯著升高,細胞凋亡率、E-cadherin、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著降低,與M-PST組、H-PST組的作用效果呈相反的趨勢,而GA-017和PST共同處理G292細胞發現,PST對G292細胞惡性行為的抑制作用被GA-017部分逆轉,提示PST可能通過下調YAP/TAZ信號軸抑制OS的進展。本研究不足之處在于缺少臨床數據,將在下一步實驗實施。

4 結論

PST可能通過調控YAP/TAZ信號軸影響OS細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲,進而抑制OS發展。