慢性牙周炎患者血清RORA的表達水平及其與Th17/Treg細胞平衡的相關性*

趙雅靜 劉淑英 陳曉川 孫天語

(南方醫科大學口腔醫院牙周病科,廣東 廣州 510200)

慢性牙周炎(Chronic periodontitis,CP)是由失調的口腔微生物群引起的,是常見的牙齒支持組織炎癥性疾病,具有較高的發病率[1]。研究發現,革蘭氏陰性菌感染是發生CP的主要原因,T淋巴細胞、巨噬細胞、上皮細胞和促炎細胞因子等與免疫反應有關,其共同作用是牙周炎病原菌的免疫屏障[2]。其中,輔助性T細胞17(T Helper cells 17,Th17)與調節性T細胞(Regulatory T cells,Treg)的比例在正常機體內處于動態平衡,二者失去平衡由一方主導時可能導致炎癥反應的發生。在CP發生發展過程中,Th17細胞及其關鍵細胞因子白細胞介素-17(IL-17)和白細胞介素-23(IL-23)起著關鍵作用[3],也有學者指出,隨著CP病情的加重,Th17/Treg細胞比例依次升高,其可能是CP患者病情評估重要指標[4-5]。維甲酸受體相關孤兒受體A(RAR-related orphan receptor A,RORA)是一種核受體,在調節細胞免疫方面發揮重要作用,并且RORA水平與Treg細胞有關[6]。研究發現,長鏈非編碼RNA TUG1通過調節miR-498/RORA通路參與LPS誘導的牙周炎[7]。研究發現,與正常對照組相比,牙周炎組織中的RORA mRNA和蛋白水平顯著下調[8],這提示RORA可能參與牙周炎的發生發展。然而,RORA在CP中發揮何種作用目前仍未可知。免疫系統失衡是CP發生的重要影響因素,因此,本研究通過檢測CP患者血清RORA水平,分析RORA與Th17/Treg細胞平衡的關系,以期為CP的發病機制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月—2021年12月于本院進行檢查并接受治療的90例CP患者作為觀察組。納入標準:①符合CP診斷標準[9]。②患者及親屬了解本研究并簽署知情同意書。③首次確診并在我院接受治療。④至少具有10顆天然牙。排除標準:①精神狀態異常,無法正常交流。②在6個月內曾服用抗菌藥物。③有吸煙史。④患有免疫相關的疾病。⑤臨床信息不完整。另選擇同期在本院檢查的牙周健康志愿者100例作為對照組。本研究獲醫院醫學倫理委員會審批(批號:201812-0126)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集兩組患者一般資料,包括年齡、性別、體質指數(BMI)及并發高血壓、冠心病、糖尿病情況。

1.2.2 血清RORA表達水平的檢測 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測CP患者及健康體檢者血清中RORA的相對表達水平。采用Trizol試劑(美國Ambion公司)從血清樣本中提取總RNA,測定其濃度和純度,按逆轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)操作步驟逆轉錄合成cDNA,采用SLAN-96S型qRT-PCR儀(致善生物科技有限公司)進行檢測。其中qRT-PCR反應體系共20 μL:cDNA(50 ng/μL)2 μL,2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)10 μL,PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,加ddH2O至20 μL。PCR反應條件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;60 ℃,30 s,共40個循環。使用2-ΔΔCt方法(Ct為循環閾值)計算目的基因RORA的相對表達量。RORA正向引物:5′‐CTGACGCCCACCTACAACAT-3′,反向引物:5′-GCCTGATGCTGGTGTGTAGT-3′;內參GAPDH正向引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反向引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.3 Th17、Treg細胞水平的檢測 采集CP患者治療前及健康體檢者的晨起空腹靜脈血2 mL,加入抗凝劑,3 000 r/min,離心20 min,分離外周血單個核細胞進行體外培養。取兩管加入FITC-鼠抗人CD4抗體,然后分別在兩試管中加入抗人IL-17A抗體、抗人Foxp3抗體以區分Th17、Treg細胞,按照說明書進行操作,使用流式細胞儀(美國BD FACSCantoII)檢測Th17、Treg細胞水平。FITC-鼠抗人CD4抗體(貨號:9522-02)購自廈門慧嘉生物科技有限公司,抗人IL-17A抗體(貨號:102-P46)購自北京阿斯雷爾生物技術有限公司,抗人Foxp3抗體[貨號:Rab(P)13266]購自上海圻明生物科技有限公司。

1.2.4 細胞因子IL-10、IL-17、IL-23及轉化生長因子-β(TGF-β)水平的檢測 采集CP患者治療前及健康體檢者的晨起空腹靜脈血2 mL,室溫靜置10～20 min后,3 000 r/min,離心20 min,將上清置于無菌EP管中,用于細胞因子IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β水平的檢測。按照酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒說明書進行操作,利用多功能酶標儀(Thermo公司)測定各樣本在450 nm處的吸光度值,依據標準回歸曲線計算各組細胞因子的水平。人IL-10(貨號:ml064299)、人IL-17(貨號:ml058051)、人IL-23(貨號:ml058067)、TGF-β(貨號:ml064258)試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 觀察組:男50例,女40例;年齡22～78歲,平均(46.29±5.47)歲;BMI 20～25 kg/m2,平均(22.53±2.41)kg/m2。對照組:男46例,女54例;年齡20～70歲,平均(47.15±5.85)歲;BMI 19～25 kg/m2,平均(22.06±2.32)kg/m2。兩組年齡、性別、BMI及合并高血壓、冠心病、糖尿病等一般資料比較,差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清RORA、Th17、Treg及Th17/Treg水平的比較 觀察組患者血清中Th17水平明顯高于對照組,RORA、Treg水平低于對照組(P<0.05),且Th17/Treg細胞比例高于對照組(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 兩組血清RORA、Th17、Treg及Th17/Treg水平的比較

表2 兩組血清RORA、Th17、Treg及Th17/Treg水平的比較

2.3 兩組相關細胞因子水平的比較 觀察組TGF-β、IL-10水平低于對照組(P<0.05),而IL-17、IL-23水平高于對照組(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 兩組相關細胞因子水平的比較

表3 兩組相關細胞因子水平的比較

2.4 CP患者血清RORA與TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg的相關性分析 Pearson法分析結果顯示,CP患者血清中RORA與TGF-β、IL-10呈正相關(P<0.05),與IL-17、IL-23及Th17/Treg細胞比例呈負相關(P<0.05)。見表4、圖3。

圖3 CP患者血清RORA與TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg的相關性

表4 CP患者血清RORA與TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg的相關性

2.5 多因素分析CP發生的影響因素 以是否發生CP為因變量(賦值1=發生,0=未發生),以RORA、TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg為自變量,進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示,RORA、TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23及Th17/Treg是CP發生的影響因素(P<0.05)。見表5。

表5 Logistic回歸分析CP發生的影響因素

3 討論

CP口腔感染是由牙齒表面微生物群的失調和宿主失調的炎癥反應共同介導,可導致牙周膜和牙槽骨的進行性破壞,并伴有囊袋形成、退縮或兩者兼而有之[10-11]。CP還可能增加患惡性腫瘤的風險,嚴重影響到患者的生命安全[12]。口腔健康可以影響到個人的生活質量。因此,闡明影響CP進展的分子機制尤為重要。免疫細胞在CP疾病中的功能是近年來研究的熱點。兩個CD4+輔助性T細胞亞群Th17和Treg之間的不平衡被證明在CP的發病機制中具有重要作用[13]。并且,研究發現RORA參與CP的發生發展[14]。基于此,本研究重點關注CP患者血清中RORA的表達水平與Th17/Treg細胞平衡的相關性,探尋CP在早期篩查中的潛在標志物。

RORA屬于核激素受體超家族,作為一種廣泛表達的轉錄因子可參與調節脂質和類固醇代謝、免疫反應和晝夜節律等[15]。鄭雪晴等[16]研究發現,RORA在口腔鱗狀細胞癌組織中低表達,過表達RORA可抑制裸鼠移植瘤的生長速度及腫瘤體積。RORA在膠質母細胞瘤中低表達,RORA高表達患者生存率高[17]。由此可見,RORA作為腫瘤抑制基因在癌癥中發揮作用。本研究首先對CP患者與健康體檢者的一般臨床資料進行比較,結果發現,兩組研究對象的年齡、性別、BMI及并發高血壓、冠心病、糖尿病等指標均無統計學差異,證明臨床數據具有可比性。Wang等[18]研究發現,與正常人群相比,牙周炎患者RORA表達明顯下調,本研究結果與其一致,這提示RORA可能參與CP的病理過程,RORA可能是CP患者潛在的血清學標志物。

CD4+輔助性T細胞在激活后分化為調節性和效應性T細胞亞群,即Th1、Th2、Th17、濾泡輔助性T細胞和Tregs細胞。其中Th17細胞和Treg細胞因在機體內履行不同的功能而被廣泛關注。Th17細胞產生IL-17、IL-22和IL-23等促炎因子,募集中性粒細胞,并促進感染部位的炎癥,Treg細胞產生抗炎細胞因子IL-10和TGF-β,抑制多種免疫細胞的活性,從而抑制免疫反應[19-20]。Liu等[21]研究發現,腸道黏膜中Th17/Treg比例失衡可增加結腸炎癥發生的風險。司秀影等[22]研究發現,Th17/Treg細胞失衡可影響哮喘的發生發展。Th17/Treg細胞在多種疾病中發揮重要的免疫作用。也有學者發現,牙周炎患者血清和牙齦組織中Th17細胞的數量比Treg細胞增加的更顯著,Th17/Treg細胞比例發生失衡[23]。本研究結果發現,與對照組相比,觀察組Th17水平升高,Treg水平降低,Th17/Treg細胞比例增加(P<0.05)。這提示CP患者體內存在Th17/Treg細胞比例失衡的現象,Th17/Treg失衡是向Th17轉化,使Th17表達更有優勢。于淑琪等[24]研究發現,CP患者Th17/Treg細胞比例高于健康對照組,這提示Th17/Treg失衡可能影響CP發生發展,本研究結果與其相符,值得進一步探索。

IL-10和IL-17是調節Th17/Treg平衡的關鍵細胞因子,正常情況下,Th17、Treg細胞比例在機體內處于動態平衡,若Th17/Treg細胞的平衡狀態被打破,偏向于其中一方時,將導致機體炎癥反應及免疫功能發生異常[25]。本研究結果發現,與對照組相比,觀察組TGF-β、IL-10水平明顯降低,而IL-17、IL-23水平明顯升高,這進一步證明CP病理過程與Th17/Treg細胞比例有關,提示CP的發生發展與炎癥反應及免疫功能異常有關。研究發現,IL-35可以通過RORα和RORγ t可直接抑制IL-23的表達,從而抑制牙周炎等炎癥性疾病中的過度免疫反應[11]。上述實驗結果表明RORA、Th17/Treg細胞均可參與CP的發生發展,那么RORA能否通過調控Th17/Treg細胞的水平從而影響CP的進程呢?本研究結果顯示,CP患者血清中RORA與TGF-β、IL-10呈正相關,與IL-17、IL-23及Th17/Treg細胞比例呈負相關,這提示RORA可能通過影響Th17/Treg細胞失衡、TGF-β、IL-10水平下調及IL-17、IL-23水平上調,來促進炎癥反應的發生,進而促進CP的發生。進一步分析發現,RORA、TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23及Th17/Treg是CP發生的影響因素。這提示RORA水平降低和Th17/Treg細胞比例的失衡可加大CP發生的風險,RORA可能通過調節Th17/Treg細胞比例影響CP的進程。并且,該結果提示RORA、IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β可能是CP早期篩查的潛在指標。

4 結論

CP患者血清中RORA低表達,Th17/Treg細胞比例失衡,RORA的表達與Th17/Treg細胞比例之間呈負相關,RORA可能通過影響Th17/Treg細胞平衡,促進炎癥反應和CP疾病的發生。但二者具體影響機制還需進行大量實驗予以驗證。