基于均勻試驗設計的小漿果多酚體外協同抗氧化活性研究

關鍵詞：小漿果； 多酚； 均勻試驗； 協同效應分析； 抗氧化

中圖分類號：S184 文獻標識碼：A DOI：10. 7525/j. issn. 1006-8023. 2024. 06. 010

0引言

人體內氧化失衡可引起多種疾病，抗氧化化合物可以防止或減少細胞結構的氧化損傷。植物中的多酚類物質，是食源抗氧化劑的主要來源，尤其是水果和蔬菜中的多酚類物質占食源抗氧化物質的很大比重［1］。小漿果（如篤斯越橘、紅豆越橘、藍靛果、蔓越莓和樹莓等）果實中富含多酚類物質，包括花青素、原花青素、黃酮醇和酚酸等。這些化合物具有多個酚羥基，能夠提供電子或氫原子與自由基反應，中斷自由基鏈式反應，從而發揮強大的抗氧化作用。有研究表明多種抗氧化劑配伍后的抗氧化效果大多顯著高于使用同等劑量的單一抗氧化劑的效果［2-4］。小漿果中多種抗氧化成分之間可能存在協同作用，食用6種漿果提取物（野生藍莓、野生越桔、蔓越莓、接骨木、樹莓籽和草莓）的組合比食用單個漿果表現出更高的抗氧化能力［5］。活性物質在協同（協同/加和/拮抗）抗氧化方面與其結構和質量濃度比例具有相關性［6-7］，只有通過科學的配比，才能發揮更好的功效。多種抗氧化劑聯合使用，進行科學的配伍研究時，選取科學的試驗設計方法，不但可以減少試驗工作量，同時也可得出科學、可靠的配方比例。均勻試驗設計（Uniform Design，UD）是一種統計試驗設計方法，試驗點均勻分散且較正交試驗次數少的特點而被廣泛用于中藥方劑配伍研究［8-9］。

基于此，本研究采用均勻試驗設計，通過科學配伍，研究篤斯越橘、紅豆越橘、藍靛果和蔓越莓多酚不同組合對DPPH自由基清除能力的影響，優選出抗氧化能力較強的多種小漿果多酚協同抗氧化組合，提高小漿果多酚的抗氧化能力，提升多種小漿果果實的加工利用率，為小漿果在產品開發和食品、保健品等領域的應用提供依據。

1材料與方法

1. 1材料與儀器

篤斯越橘、紅豆越橘、藍靛果購于大興安嶺超越野生漿果開發有限責任公司，蔓越莓購于撫遠紅海植業有限公司。XDA-6樹脂購于南開大學樹脂廠；抗壞血酸（vitamin C，VC）和1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）購于Sigma公司。

ALC-110電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；S-3L pH計：上海精密儀器有限公司；UVVisEVO300分光光度計：Thermo公司；RE-52A旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；FRQ-1035ST超聲波提取儀：杭州法蘭特超聲波科技有限公司。

1. 2試驗方法

1. 2. 1樣品提取方法

4種漿果果實鮮果直接破碎后，采用超聲波輔助提取工藝提取，提取溶劑為體積分數70% 的乙醇，料液比為1∶10（g∶mL），提取溫度設定40 ℃，提取功率150 W，提取時間30 min，提取2次，合并提取液。將提取液在48 ℃條件下，旋轉蒸發濃縮后凍干得到4種漿果多酚的粗提物，分別標記為D-0（篤斯越橘多酚粗提物）、H-0（紅豆越橘多酚粗提物）、L-0（藍靛果多酚粗提物）、M-0（蔓越莓多酚粗提物）。

1. 2. 2樣品純化方法

采用柱層析法，以XDA-6為介質，依次以蒸餾水、10%乙醇水溶液、40%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液為流動相進行梯度洗脫，對漿果多酚粗提取物進行分離純化，收集不同質量濃度乙醇洗脫液，經減壓濃縮、真空冷凍，得到漿果多酚凍干粉。分別標記為D1（篤斯越橘10%乙醇洗脫物）、D2（篤斯越橘40% 乙醇洗脫物）D3（篤斯越橘70% 乙醇洗脫物）；H1（紅豆越橘10%乙醇洗脫物）、H2（紅豆越橘40%乙醇洗脫物）、H3（紅豆越橘70%乙醇洗脫物）；L1（藍靛果10%乙醇洗脫物）、L2（藍靛果40%乙醇洗脫物）、L3（藍靛果70%乙醇洗脫物）；M1（蔓越莓10% 乙醇洗脫物）、M2（蔓越莓40% 乙醇洗脫物）、M3（蔓越莓70%乙醇洗脫物）。

1. 2. 3總多酚含量、DPPH和羥自由基檢測方法

總多酚含量參照文獻［10］，采用福林酚法進行檢測。分別稱取4種漿果多酚粗提物和多酚純化物的凍干粉100 mg，溶于10. 0 mL 蒸餾水中，備用。DPPH自由基清除率參照Blois［11］和徐宜彬等［12］的研究方法，分別稱取陽性對照VC粉末、4種漿果多酚粗提物和多酚純化物的凍干粉100 mg，溶于10. 0 mL蒸餾水中，配成10 mg/mL 溶液，然后按照梯度0、0. 025、0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8 mg/mL進行稀釋，配成不同質量濃度的溶液進行清除DPPH自由基能力檢測。羥自由基清除率參照王化等［13］的研究方法，分別稱取陽性對照VC粉末及D2、H2、L2的凍干粉100 mg，溶于10. 0 mL 蒸餾水中，配成10 mg/mL 溶液，然后根據需要單一組分及組合配成不同質量濃度的溶液進行清除羥自由基能力試驗研究。

1. 2. 4協同效應分析方法

協同效應分析基于Chou-Talalay法［7，14］，衡量指標是協同指數（Combination Index，CI，式中記為CI），計算公式為

1. 2. 5統計學處理

采用SPSS26. 0統計軟件和Excel軟件對數據進行回歸和方差分析處理，多組間采用單因素方差分析（One Way ANOVA），數據均采用平均值±標準誤（x?±Se，n=3）表示，利用GraphpadPrism 8. 2. 0軟件計算IC₅₀值和作圖。

2結果與分析

2. 1 4種小漿果多酚組分總多酚含量

4種小漿果多酚純化物（D1—D3、H1—H3、L1—L3、M1—M3）各組分的多酚含量均顯著高于各自的粗提物（D0、H0、L0、M0）組分的多酚含量（Plt;0. 05），如圖1 所示。各組分純化產物中均為第2 段（D2、H2、L2、M2）的多酚含量最高，均顯著高于其他組分（Plt;0. 05），純度均達到了40% 以上，并且D2 和L2的純度達到了50%以上。

2. 2 4種小漿果多酚清除DPPH 自由基能力組分優選

由圖2可知，4種小漿果多酚粗提物及純化產物清除DPPH 自由基的能力，在試驗選定的0. 025～0. 80 mg/mL均隨著質量濃度的升高而升高；并且在每組中，均是第2段的多酚純化產物（D2、E2、L2、M2）活性最高，這可能與這段純化產物中的多酚含量高有關。后續試驗中，每種小漿果均選取活性最高的這段組分進行后續研究。

2. 3 4種小漿果多酚清除DPPH自由基能力的IC₅₀值比較研究

圖3是以VC為對照，4種小漿果抗氧化最強活性多酚組分隨著質量濃度的升高清除DPPH自由基能力的趨勢圖及IC₅₀值比較，由圖4可知，4種小漿果第2段多酚純化產物清除DPPH自由基的能力均顯著低于VC對照組（Plt;0. 01），說明這4種小漿果多酚純化產物的清除DPPH自由基能力低于VC。并且在幾個小漿果多酚組分中D2和H2的IC₅₀值顯著低于L2和M2，說明這2種小漿果多酚的清除DPPH自由基能力要優于另外2種。幾種小漿果多酚清除DPPH自由基能力由高到低的順序為D2、H2、L2、M2。

2. 4 4種小漿果多酚組分協同抗氧化能力組合優選

2. 4. 1 4種小漿果多酚組分均勻試驗結果及分析

以4種小漿果第2段多酚純化產物的IC50值為基礎，采用均勻試驗設計，根據方開泰［15］的四因素15水平設計，采用均勻設計表U15*（157）的使用表（S=4，D=0. 155 1，S 表示選擇的列數，D 表示均勻度的偏差，使用原表的1、2、4、6列），每個因素以0為起點，每個質量濃度間隔0. 0055 mg/mL，設置15 個梯度，以清除DPPH自由基能力為響應指標，研究不同組合對抗氧化能力的影響，以優選出最佳組合。15個組合的編碼變量、過程變量及清除DPPH自由基的結果見表1。

利用SPSS26. 0統計軟件和Excel軟件對研究結果進行方差和回歸分析，由表2方差分析結果可見，模型回歸顯著性Plt;0.01，表明模型具有顯著性，模型R²為0. 947，表明模型可用。

在4個因素中篤斯越橘多酚化合物（D2）對DPPH自由基的清除率具有顯著影響（Plt;0. 05），見表3。紅豆越橘多酚化合物（H2）、藍靛果多酚化合物（L2）和蔓越莓多酚化合物（M2）3個因素對DPPH自由基的清除率均具有極顯著影響（Plt;0. 01）。

通過回歸擬合，可得到各因素和清除率的回歸方程為：Y = 39. 546 + 48. 949 × D₂ + 164. 034 × H₂+208. 018×L₂+162. 763 × M₂，式中， D₂、H₂、L₂、M₂代表D2、H2、L2、M2清除率。根據試驗需求，約束目標函數最大清除率為100%，得到4個因素清除DPPH自由基的最佳組合為篤斯越橘41. 50 μg/mL、紅豆越橘137. 79μg/mL、藍靛果172. 20μg/mL、蔓越莓為0μg/mL，比例約為（14∶46∶57∶0）（表1），即不加蔓越莓多酚時，其他3種小漿果多酚進行組合的抗氧化能力最好。有研究表明活性物質在協同（協同/加和/拮抗）抗氧化方面與其結構具有相關性。3，7-二羥基黃酮與5-羥基黃酮、6-羥基黃酮和5，6，7-三羥基黃酮聯合作用時，表現為協同作用；而6-羥基黃酮與5-羥基黃酮和7-羥基黃酮表現為拮抗作用［16］。這可能是蔓越莓多酚中的某種結構與其他3種漿果中的多酚結構發生了拮抗作用，具體是哪個結構影響了組合的抗氧化活性，有待進一步研究。

2. 4. 2優化結果驗證

為進一步驗證方程得到的質量濃度配比是否具有可行性，采用確定的優化條件進行3次平行試驗，同時考慮到實際操作的情況，調整最佳組合質量濃度為：篤斯越橘多酚（D2）42 μg/mL、紅豆越橘（H2）138 μg/mL；藍靛果（L2）172μg/mL，進行復配驗證試驗，此組合實際驗證結果清除率為98. 07%±0. 31%。

通過計算預測值與實際值的相對偏差，也可作為回歸方程擬合程度的判斷，公式為X_相對偏差=| （Y | _實際值- Y_預測值）/Y_實際值×100%。本研究實際值與目標推測值100%比較偏差為1. 93%，結果小于5. 0%，相對偏差較小，說明結果較為準確，可以較好地反映實際情況，此模型具有可行性。因此，采用均勻試驗設計得到的最佳組合條件準確可靠，具有實用價值。

2. 5協同效應分析

以常用抗氧化劑VC為對照，以優選出的組合處理組總質量濃度0. 352mg/mL為實驗質量濃度，通過對相同物質含量的組合及單一組分進行清除DPPH自由基和羥自由基對比研究，結果如圖4所示，研究發現優選出的組合清除DPPH自由基和羥自由基的能力極顯著高于D2、H2、L2單一組分（Plt;0. 01），其IC50值也極顯著低于D2、H2、L2單一組分（Plt;0. 01），說明篤斯越橘多酚（D2）、紅豆越橘多酚（H2）、藍靛果多酚（L2）3種物質組合抗氧化能力具有協同增效的作用，并且通過組合之后其清除DPPH自由基的抗氧化能力顯著高于VC對照組（Plt;0. 01），清除羥自由的能力與VC對照組無顯著差異（Pgt;0. 05）

協同效應分為協同、拮抗、加和3種。有研究表明活性物質在協同（協同、加和、拮抗）抗氧化方面與其質量濃度比例具有相關性。綠原酸與蘆丁濃度比值為4. 5∶1時，對超氧陰離子清除能力表現為協同作用，而當兩者濃度比值為1∶2時，則表現出拮抗作用［17］。為了進一步驗證均勻試驗優化出的最佳組合是否具有協同增效作用，利用協同效用方程對均勻試驗優化出的最佳組合進行協同效應分析，當CI值小于1，表明2種（或2種以上）物質間具有協同增強作用，并且當CI小于0. 7時，表示協同作用非常顯著［18］，經協同效應分析（表4），均勻試驗優化出的最佳組合清除DPPH自由基的CI值為0. 57，清除羥自由基的CI值為0. 64，這表明3種小漿果多酚通過適宜配伍，在抗氧化方面具有顯著的協同增效作用。

3結論

本研究采用均勻試驗設計方法，優化出了幾種小漿果多酚抗氧化能力的最佳配伍組合：篤斯越橘多酚（D2）∶紅豆越橘（H2）∶藍靛果（L2）為14∶46∶57，其最佳質量濃度分別為42、138、172 μg/mL，其抗氧化能力達到了98. 07%±0. 31%，與預測值比較偏差為1. 93%，結果小于5. 0%，相對偏差較小，說明結果較為準確，通過均勻試驗得到的模型具有可行性。通過協同效應分析，優選出的組合清除DPPH自由基和羥自由基的協同效應指數CI 值分別為0. 57 和0. 64，表明優選出的組合在體外抗氧化活性方面具有顯著的協同增效作用。隨著協同抗氧化劑的研究不斷深入，其在提高抗氧化能力和預防疾病方面具有很大的潛力，后續研究將進一步探索其作用機制。