Treg細胞抑制慢性中耳炎模型小鼠中耳炎癥的進展

王 丹,楊啟梅,劉曉娜,陳菁華(西北婦女兒童醫(yī)院耳鼻喉科,西安 7006;陜西省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;通訊作者,E-mail:703379@qq.com)

慢性中耳炎(chronic otitis media,COM)是臨床上多發(fā)的兒童性疾病[1],主要分為慢性分泌性中耳炎和慢性化膿性中耳炎[2,3],疾病的發(fā)展會導致聽力損失、語言發(fā)育延遲以及永久性中耳損傷等[4]。研究表明,在COM的細菌感染中,大多數(shù)病例是由革蘭氏陰性菌引起[5]。脂多糖是革蘭氏陰性菌的一種成分,已在人類中耳積液(middle ear fluid,MEE)中檢測到[6],其在慢性中耳炎患者中的水平明顯高于急性中耳炎患者[7]。研究表明,COM與持續(xù)性細菌感染有關,在90%以上的COM患者的中耳黏膜(middle ear mucosa,MEM)活檢標本中均發(fā)現(xiàn)了不同的致病菌群[8]。據(jù)報道,咽鼓管(eustachian tube,ET)功能紊亂和持續(xù)的細菌感染與COM的發(fā)病機制密切相關[9]。通過ET阻斷產(chǎn)生的COM小鼠顯示出持續(xù)的漿液性中耳積液,同時伴有中耳腔內(nèi)炎性細胞浸潤(尤其是淋巴細胞)和細胞因子產(chǎn)生的組織學變化[10]。

不可分型流感嗜血桿菌(non-typeableHaemophilusinfluenzae,NTHi)被認為是COM的主要病原體[11]。NTHi菌株可以在氣道內(nèi)持續(xù)很長時間,當宿主的黏膜清除機制受損時,NTHi可以引起一系列的氣道感染[12]。目前,通常采用制造ET功能障礙和持續(xù)NTHi細菌感染構建COM動物模型,以用于研究COM的發(fā)病機制[12-14]。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg),也被稱為抑制性T細胞,是由一個特定的細胞亞群組成,在功能上抑制免疫系統(tǒng)的過度激活,保持對自我抗原的免疫耐受[15],編碼Treg細胞轉錄因子叉頭盒P3(fork headbox protein 3,Foxp3)的基因是Treg分化和功能的主基因[16]。研究表明,Treg可針對體內(nèi)的細菌、病毒和寄生蟲抗原被激活和擴大[17]。本研究通過ET阻斷和接種NTHi,建立了持續(xù)性NTHi感染的小鼠COM模型,以探究Treg對慢性中耳炎感染進展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)購自上海生工有限公司;巧克力瓊脂、多聚甲醛購自碧云天生物科技有限公司;27號針頭購自Hamilton公司(美國);山羊血清、牛血清白蛋白購自AusgeneX公司(澳大利亞);一抗TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β和CD4抗體、Foxp3抗體、CD25抗體均購自Abcam公司(美國);商用ELISA試劑盒購自R&D公司(美國);Ⅳ型膠原酶購自Sigma公司(美國);CD4+CD25+FOXP3+Treg調(diào)節(jié)性T細胞檢測試劑盒購自EXBIO公司(捷克);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 實驗動物與菌株 4周齡BALB/c小鼠購自陜西中醫(yī)藥大學【SCXK(陜)2021-001】,所有小鼠均在西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心實驗動物屏障設施中適應性飼養(yǎng)1周,然后進行動物實驗,本研究動物實驗符合動物福利規(guī)范,獲得本院倫理委員會的批準(審批號:No.2021-9-06-1035)。具有活性的不可分型流感嗜血桿菌NTHi菌株由西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 NTHi誘導實驗性COM小鼠模型 根據(jù)文獻所述研究方法[18],NTHi菌株采用巧克力瓊脂于37 ℃和5%CO2下培養(yǎng)16 h,測定細菌濃度,加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)制備濃度為2×109CFU/mL的細菌懸液。采用異氟醚吸入法麻醉小鼠后,于小鼠頜下皮膚處切口,暴露右下鼓室,切開靠近鼓室的咽鼓管(ET),并將明膠海綿插入ET(形成ET阻塞)。然后用27號針頭在鼓膜上開2個微孔,將微吸管插入其中一個孔中,緩慢接種10 μL的NTHi細菌懸浮液,每3 d注射1次,共3次。通過對小鼠進行耳鏡監(jiān)測,出現(xiàn)中耳積液和中耳黏膜組織增厚表示造模成功。本實驗設置模型組(n=40)和對照組(n=40),模型組為造模成功的小鼠,對照組為未進行ET阻斷和NTHi接種的小鼠。

分別在末次注射后的第3天(M3 d組)、第14天(M14 d組)、第28天(M28 d組)和第56天(M56 d組),模型組和對照組均各取8只小鼠給予腹腔注射3%戊巴比妥麻醉處理并斷頭處死。對各只小鼠進行耳鏡監(jiān)測,確認MEE狀態(tài)和鼓膜的變化。根據(jù)分級標準[19]進行炎癥嚴重程度評分:0分,灰色和半透明的鼓膜,沒有MEE;1分,灰色和不透明的鼓膜,有漿液性MEE或黏液性MEE;2分,黃色和不透明鼓膜,有膿性MEE;3分,不透明鼓膜,有漿液性MEE。收集各只小鼠MEE,取部分連續(xù)稀釋后將樣品置于巧克力瓊脂上,培養(yǎng)并計數(shù)細菌菌落。使用200 μL生理鹽水清洗小鼠中耳,分離收集小鼠中耳組織和中耳黏膜組織后續(xù)實驗備用。

1.2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測小鼠中耳黏膜組織炎性病變程度 各組小鼠中耳黏膜組織使用4%多聚甲醛固定48 h,并在0.12 mol/L的EDTA溶液(pH=7.4)中脫鈣后,再進行梯度乙醇脫水和二甲苯處理,然后包埋于石蠟切成4 μm厚度切片。按照試劑盒方法進行HE染色,使用Image J軟件檢測和分析黏膜厚度和MEM中的炎性細胞數(shù)量,采用光學顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 免疫組織化學檢測CD4+和Foxp3+細胞水平 取1.2.2項下制好的石蠟切片,于室溫下用3%的H2O2處理15 min。再將切片于含5%正常山羊血清的PBS緩沖液中封閉處理30 min,然后加入兔抗小鼠CD4抗體(1∶500)或兔抗小鼠Foxp3抗體(1∶500)于含1%牛血清白蛋白的PBS緩沖液于室溫下孵育12 h。PBS清洗后,切片與加入生物素化的山羊抗兔抗體(1∶1 000)的1%牛血清白蛋白的PBS緩沖液于室溫下孵育6 h。用PBS沖洗后,經(jīng)過DAB液顯色,然后蘇木素染色、藍化、脫水和透明處理,最后中性樹膠封片,采用光學顯微鏡觀察并拍照,采用Image J軟件量化陽性染色強度。

1.2.4 ELISA檢測小鼠MEE中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平 取1.2.1項下收集的MEE,按照ELISA試劑盒方法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-10和轉化生長因子(TGF-β)的水平。

1.2.5 Western blot檢測小鼠中耳黏膜組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β蛋白表達水平 取方法1.2.1項下分離收集的各組小鼠中耳黏膜組織,加入RIPA裂解液提取組織總蛋白,采用BCA試劑盒對總蛋白定量。再經(jīng)過12%的SDS-PAGE電泳分離蛋白條帶,轉移至PVDF膜,然后加入5%的脫脂牛奶封閉。加入一抗TNF-α(1∶500)、IL-1β(1∶1 000)、IL-10(1∶500)和TGF-β(1∶500)于4 ℃下孵育過夜。再加入稀釋后的二抗于室溫下孵育2 h,經(jīng)過ECL顯色和曝光后成像。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.2.6 流式細胞術檢測分析小鼠中耳黏膜組織CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞水平 參考文獻[20]方法,取1.2.1項下收集的小鼠新鮮中耳黏膜組織,采用0.5 mg/mL的Ⅳ型膠原酶解離處理組織,分離并培養(yǎng)制作獲得單細胞懸浮液,調(diào)整細胞密度為1.0×106個/mL用于流式細胞術檢測。單細胞懸浮液中加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗CD4單克隆抗體mAb、藻紅素(PE)標記的抗Foxp3 mAb和別藻藍蛋白(APC)標記的抗CD25 mAb,然后4℃下避光處理30 min,PBS洗滌后流式細胞儀上機檢測分析CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+比例,采用Cell Quest軟件分析Treg的免疫熒光強度。

1.2.7 注射抗CD25 mAb模擬體內(nèi)Treg耗竭并檢測T細胞和炎性因子水平 參考文獻[21]方法,在ET阻斷和NTHi接種處理后第14,28,42天,每只小鼠腹腔注射125 μl抗-CD25 mAb(作為抗-CD25組,n=8),PBS組小鼠腹腔注射等體積PBS(n=8)。在治療第56天后,小鼠腹腔注射3%戊巴比妥麻醉處理后斷頭處死,立即分離收集脾臟、頸部淋巴結和中耳黏膜組織,采用IV型膠原酶解離處理制作獲得單細胞懸浮液。按照1.2.6所述檢測脾臟、頸部淋巴結和中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg陽性細胞百分比;按照1.2.1所述收集各只小鼠MEE,培養(yǎng)并計數(shù)細菌菌落;按照1.2.3所述檢測中耳黏膜組織單細胞懸浮液中TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β的水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結果

2.1 NTHi成功誘導構建小鼠COM模型

與對照組相比,模型組小鼠均在3 d后出現(xiàn)中耳積液且為膿性,在第14天炎癥嚴重程度和細菌數(shù)量均至最高值;從第28天至第56天,小鼠炎癥嚴重程度和中耳積液細菌數(shù)量均呈一定程度下降,但相較于對照組仍處于較高水平(P<0.05,見表1)。

表1 兩組小鼠中耳炎癥嚴重程度和中耳積液細菌數(shù)量比較Table 1 Comparison of the severity of middle ear inflammation and the number of bacteria in middle ear effusion between the two groups of mice

2.2 NTHi誘導的COM小鼠中耳黏膜組織炎性細胞浸潤和黏膜厚度增加

HE染色結果顯示,對照組小鼠中耳黏膜組織正常;與對照組比較,模型組小鼠接種后第3天,小鼠中耳黏膜組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤,炎性細胞數(shù)量和黏膜厚度增加(P<0.05),到第14天至最高值;接種后第28天至第56天,小鼠中耳黏膜厚度和炎性細胞浸潤程度增加趨勢稍有減緩(P<0.05,見圖1)。

注:與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖1 NTHi誘導的COM小鼠中耳黏膜組織炎癥和黏膜厚度變化Figure 1 Changes of inflammation and mucosal thickness in mucosal tissue of COM mice induced by NTHi

2.3 NTHi誘導的COM小鼠中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞水平升高

免疫組化結果顯示,模型組小鼠接種后第3天,中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細胞陽性染色水平升高,從接種后第28天至第56天,中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細胞陽性染色水平升高趨勢稍有緩解(見圖2)。流式細胞術檢測結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠接種后第3天,中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+細胞水平升高(P<0.05),到第14天至最高值;接種后第28天至第56天,與對照組相比仍處于較高水平(P<0.05,見圖3)。

圖2 免疫組織化學檢測小鼠中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細胞變化Figure 2 Changes of CD4+ and Foxp3+ cells in mouse middle ear mucosa detected by immunohistochemistry

注:與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖3 流式細胞術檢測小鼠中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+細胞變化Figure 3 Changes of CD4+CD25+Foxp3+ cells in mouse middle ear mucosa detected by flow cytometry

2.4 NTHi誘導的COM小鼠中耳積液和中耳黏膜組織中炎性因子水平升高

ELISA檢測結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠接種后第3天,中耳積液中促炎因子IL-1β和TNF-α的水平達到最高(P<0.001),在第14天抑炎因子IL-10和TGF-β的水平達到最高(P<0.001),在第28,56天,IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平均呈下降趨勢,但與對照組相比仍處于較高水平(P<0.01,見圖4)。Western blot檢測小鼠中耳黏膜組織中炎性因子水平結果變化趨勢與ELISA檢測結果一致(見圖5)。

注:與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001。圖4 ELISA檢測小鼠中耳積液中炎性因子表達水平變化Figure 4 Expressions of inflammatory factors in the middle ear effusion of mice detected by ELISA

注:與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001。圖5 Western blot檢測小鼠中耳黏膜組織中炎性因子表達水平變化Figure 5 Expressions of inflammatory factors in mouse middle ear mucosa detected by Western blot

2.5 Treg細胞消耗對COM小鼠細菌清除和炎癥的影響

流式細胞術結果顯示,與PBS組小鼠相比,抗-CD25組小鼠中耳黏膜、脾臟和頸部淋巴結組織中CD4+CD25+Foxp3+細胞比例均顯著降低(P<0.05,見圖6)。細菌計數(shù)和炎性因子檢測結果顯示,與PBS組小鼠相比,抗-CD25組小鼠中耳積液中細菌數(shù)和中耳黏膜組織中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平均降低(P<0.01,見圖7)。

圖6 抗CD25 mAb對小鼠中耳黏膜組織、脾臟和頸部淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+細胞的影響Figure 6 Effect of anti-CD25 mAb on CD4+CD25+Foxp3+ cells in middle ear mucosa tissue, spleen and cervical lymph nodes of mice

注:與PBS組相比,**P<0.01。圖7 抗CD25 mAb對小鼠中耳積液細菌數(shù)和中耳黏膜組織中炎性因子水平的影響Figure 7 Effects of anti-CD25 mAb on bacterial count and inflammatory factors in middle ear effusion of mice

3 討論

慢性中耳炎(COM)是中耳和乳突腔的一種慢性炎癥,通常由復發(fā)性急性中耳炎發(fā)展而來,涉及多微生物的感染[22]。NTHi被認為是呼吸道感染疾病的重要病原菌,也是急性中耳炎的主要病原體[23]。先前有研究報道[24],接種NTHi誘發(fā)了栗鼠的急性中耳炎,但在14 d后,僅能檢測到少量具有活性的NTHi,而在大鼠急性中耳炎模型中8 d后檢測不到NTHi的存在。以上動物造模過程中并沒有實施ET阻斷處理,而中耳的感染進程也僅限于幾個星期。在本研究中,通過將NTHi接種至中耳并采用ET阻斷處理成功建立了COM小鼠模型。結果顯示,COM小鼠的中耳黏膜增厚,且出現(xiàn)炎性細胞浸潤;在造模后第56天,COM小鼠中耳黏膜組織仍存在炎癥病理狀態(tài),且在COM小鼠的中耳積液中均檢測到NTHi的存在。

CD4+CD25+Foxp3+Treg作為T淋巴細胞亞群的成員,主要對機體免疫反應起到負調(diào)控作用,通過免疫抑制作用讓機體產(chǎn)生免疫耐受性,以防止自身免疫疾病的發(fā)生,同時還會導致炎癥反應趨向慢性發(fā)展[25]。研究顯示,在健康黏膜中觀察到T細胞輔助亞群的平衡在炎癥黏膜中發(fā)生改變,CD4+/CD8+T細胞的比例根據(jù)慢性鼻炎炎癥的嚴重程度而增加[19]。本研究結果表明,與對照組相比,模型組COM小鼠中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細胞和CD4+CD25+Foxp3+細胞比例均發(fā)生不同程度的升高,這表明Treg在COM發(fā)生過程中已發(fā)揮免疫效應。也有報道顯示,Treg細胞與炎癥反應的發(fā)生密切相關,且具有一定的抗炎作用,研究認為Treg細胞通過對機體免疫系統(tǒng)過度活化和病理性自身免疫反應的抑制,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,維持機體免疫平衡,同時還可以發(fā)揮抗炎作用[26]。本研究中,與對照組比較,模型組COM小鼠隨著造模時間的延長,小鼠中耳積液和中耳黏膜組織中促炎性因子IL-1β和TNF-α水平迅速升高,這些促炎因子激活機體先天和獲得性免疫系統(tǒng)清除侵入的抗原;同時也檢測到抑炎因子IL-10和TGF-β水平的升高,這可能提示機體內(nèi)T淋巴細胞亞群CD4+CD25+Foxp3+Treg發(fā)揮免疫抑制作用,通過分泌或誘導產(chǎn)生抑炎因子IL-10和TGF-β,以維持機體內(nèi)炎癥反應的平衡,促使機體恢復正常免疫和生理水平,避免產(chǎn)生自身免疫性傷害。

CD4+T細胞可通過TGF-β誘導的Foxp3的表達轉化為CD4+Treg[27]。1型調(diào)節(jié)性T細胞(Tr1細胞)通過產(chǎn)生高水平的IL-10來抑制抗原特異性免疫反應,而Tr1細胞在激活后可暫時表達Foxp3;調(diào)節(jié)T細胞3型(Th3)通過產(chǎn)生高水平的TGF-β以驅動外周抗原特異性Foxp3調(diào)節(jié)細胞的分化,在誘導和維持外周耐受方面發(fā)揮了關鍵作用[28]。在本研究中,這些Treg被認為與NTHi感染中的持續(xù)炎癥有關。眾所周知,Treg在控制感染性疾病(包括病毒、寄生蟲和細菌)方面發(fā)揮著重要作用,Treg在宿主防御中發(fā)揮著兩種不同的關鍵免疫作用(保護性或有害性)[29]。Treg細胞已成為機體對細菌、真菌和病毒免疫抵抗的重要組成部分,其發(fā)揮的免疫防御功能有效減輕了機體組織損傷程度,但另一方面也導致機體對入侵病原體的免疫反應降低,致使病原體在宿主體內(nèi)持久存在[30]。研究表明,結核分枝桿菌對機體的持久性感染與Treg細胞在損傷組織內(nèi)持續(xù)增殖和聚集密切相關,而當對Treg細胞適當消耗后,小鼠對結核分枝桿菌的負擔顯著下降[31]。嚴唯[32]研究發(fā)現(xiàn),煙曲霉菌感染小鼠肺部后,CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞參與了抑制宿主炎癥反應過程,但同時也抑制了宿主對煙曲霉菌的清除作用;當模型小鼠腹腔注射CD25中和抗體后,CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例下降,受感染的小鼠肺部對煙曲霉菌的負荷也下降。在本研究中,COM小鼠腹腔注射抗-CD25 mAb后,第56天CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例顯著下降,同時MEE中的細菌數(shù)量也顯著減少,這表明機體過度免疫后,CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的適當降低,能夠促進宿主對細菌的清除作用,該結果與嚴唯[32]的研究結果一致。

本研究證明了Treg細胞在慢性中耳炎中發(fā)揮免疫保護和抑制自身免疫性傷害兩種不同免疫作用,同時發(fā)現(xiàn)在中耳局部的免疫應答中Treg細胞發(fā)揮主要免疫作用,但炎癥作為一種可能涉及全身組織器官的反應,慢性中耳炎所引起的全身和局部免疫應答中Treg細胞是否仍處于主導免疫角色未可知,這也是本研究的局限性之一。同時,本研究未對慢性中耳炎小鼠Treg細胞發(fā)揮免疫效應可能涉及到的分子信號通路做深入的解析,與T細胞分化相關的PI3K/Akt/mTOR信號通路[15],以及與中耳炎相關的TGF-β信號通路[33],都有可能是慢性中耳炎中Treg細胞發(fā)揮免疫作用的分子機制,這也是未來研究需要深度解析的方向。

綜上所述,本研究成功構建NTHi可持續(xù)感染的COM小鼠模型,Treg細胞在慢性中耳炎的炎癥平衡維持中具有重要作用,抑制炎癥的進展,但過度的Treg細胞抑制了宿主對細菌的清除作用。