酶底物光譜法與酶底物法檢測水中大腸菌群的比較分析

王莉莉

(1.廣西北投環保水務集團有限公司,廣西南寧 530025;2.南寧市水安全工程技術研究中心,廣西南寧 530025)

世界衛生組織統計,每年全球超過150萬人由于飲用不安全的水死于腹瀉病,其中大多數是嬰幼兒。與飲用水相關的最常見和最普遍的健康風險來自通過糞便傳播的微生物病原體引起的污染。全球最常用的水被糞便污染的指示菌是大腸埃希氏菌,每100 mL樣品中大腸埃希氏菌超過100 CFU被認為是“非常高風險”的糞便污染水平,如未檢出可被認為是低風險的[1]。據文獻[2]顯示,我國地表水體糞大腸菌群含量普遍較高,受到較為嚴重的糞便污染,其中河流水系含量最高,湖泊、海域次之。原水糞大腸菌群污染的加劇對水域游泳等直接身體接觸活動人群存在明顯健康影響[3],水體中糞大腸菌群含量與有機物、富營養化程度正相關[2]。因此,檢測水中大腸桿菌含量對于預防疾病、居民健康、水源保護、水質評價及風險預警等具有重要作用和意義。目前,在生活飲用水、環境水、城鎮污水相關的國家水質衛生標準文件中,對于水質大腸菌群的濃度表征及風險提示,主要采用總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群3項指標,此3項指標是常用于評價水體被糞便污染程度的指標菌,檢測方法以多管發酵法、濾膜法為主,其次為酶底物法。酶底物法具有操作簡單、快速、準確的優勢[4-7],近10年在國內得到廣泛推廣運用。目前市場上出現一類基于酶底物反應原理的水質微生物自動檢測分析儀,具備一鍵操作完成檢測及報告結果的功能。本文采用檢測儀(酶底物光譜法)與國標酶底物法檢測不同類型的水質樣品中的總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群指標,研究兩種檢測方法的相關性,采用酶底物光譜法檢測有證標準物質,驗證該方法的準確性,為開展水質大腸桿菌的檢測提供備選方法。

1 試驗材料和方法

1.1 主要設備與材料

TECTA-B16全自動微生物檢測系統(檢測儀)、TECTA測試套筒由北京華夏科創儀器股份有限公司提供;無菌采樣瓶、97孔定量盤、科立得試劑等耗材購自美國IDEXX公司授權的經銷商;HJQC-003酶底物法質控樣品購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。其余主要試驗設備包括程控定量封口機、紫外線燈、上海一恒電熱培養箱。

1.2 方法原理

(1)酶底物光譜法:在特定溫度下培養特定的時間,總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群能產生β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶,分解選擇性培養基中的底物生成熒光物質;利用光學原理,通過進行連續的分光光度測定,依據待測水樣熒光強度的變化與水中待測目標細菌的濃度的特殊對應關系,建立相關數學模型從而測定總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群的濃度。反應原理如圖1所示。

圖1 酶底物光譜法的反應原理

(2)酶底物法:酶底物試劑包含ONPG和MUG這兩種營養指示劑,分別會被大腸菌群酶(β-半乳糖苷酶)和大腸埃希氏菌酶(β-葡糖醛酸酶)代謝。在特定溫度下培養特定的時間,總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌生長代謝過程中產生特異性的酶,使培養基產生顯色反應,樣品從無色變成黃色;大腸埃希氏菌的產物在紫外燈照射下有藍色熒光。通過統計陽性反應數量,查最大可能數(MPN)表,可以計算出對應項目指標的濃度值。

1.3 試驗步驟

(1)酶底物光譜法:參照全自動微生物檢測系統的儀器操作說明書進行。根據檢測項目,在微生物檢測儀上選擇相應的測試模式。接種待測水樣于裝有培養基的一次性測試套筒中,定容至100 mL,水樣與培養基應充分混勻,將接種后的測試套筒放置于儀器中,經過2～18 h培養,儀器自動輸出檢測結果。測定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時,接種到CCA測試套筒,培養溫度為(35.5±0.2)℃;測定糞大腸菌群時,接種到FCA測試套筒,培養溫度為(44.5±0.2)℃。檢測樣品的操作步驟如圖2所示。

圖2 酶底物光譜法檢測樣品的操作步驟

(2)酶底物法:依據《水質 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》(HJ 1001—2018)、《生活飲用水標準檢驗方法 第12部分:微生物指標》(GB/T 5750.12—2023)5.3酶底物法、7.3酶底物法中的檢測步驟進行[8-9]。

(3)以南寧地區實際樣品進行試驗,生活飲用水、井水樣品依據《生活飲用水標準檢驗方法 第2部分:水樣的采集與保存》(GB/T 5750.2—2023)進行采樣,地表水、污水等樣品依據《水質 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法》(HJ 1001—2018)進行樣品采集和保存。采樣容器為滅菌玻璃瓶,也可用市售無菌采樣瓶或無菌采樣袋替代,如樣品含有余氯,可在玻璃瓶滅菌處理前預先添加硫代硫酸鈉[8,10]。

(4)數據統計分析使用Office和IBM SPSS Statistics軟件,繪圖使用Origin 2022軟件。

2 結果與討論

2.1 實際樣品的檢測分析

(1)對南寧地區生活飲用水43個樣品(包括自來水廠出廠水18個樣品、市政管網水25個樣品)檢測總大腸菌群、大腸埃希氏菌。兩種方法對生活飲用水的檢測結果均為陰性、未檢出,可認為兩種方法試驗結果具有一致性,均可有效檢測潔凈水中的總大腸菌群、大腸埃希氏菌。

(2)對南寧地區30個環境水樣品檢測總大腸菌群、大腸埃希氏菌,樣品類型包括井水、地下水、地表水,檢測結果如表1所示。因為微生物檢測數據屬于偏態分布,所以將測定結果以10取對數后進行計算。因為0沒有對數,結果為未檢出(<1)的數據在統計時按0.1進行對數處理。運用SPSS軟件對處理后數據進行配對t檢驗,結果顯示:兩組總大腸菌群的數據P=0.057(P>0.05),相關系數r=0.904;兩組大腸埃希氏菌的數據P=0.593(P>0.05),相關系數r=0.972。結果表明,比對數據相關性較好,兩種方法在檢測總大腸菌群、大腸埃希氏菌時沒有統計學意義上的顯著差異性,具有等效性、可比性。結果比較如圖3所示。

表1 兩種方法檢測南寧地區環境水樣品中的總大腸菌群、大腸埃希氏菌的結果

圖3 兩種方法檢測南寧地區環境水樣品中的總大腸菌群、大腸埃希氏菌的對數結果比較

(3)對南寧市區污水處理廠30個污水樣品檢測糞大腸菌群,污水樣品包括城鎮污水處理廠的進廠污水、經工藝處理后污水,檢測結果如表2所示。運用SPSS軟件對處理后數據進行配對t檢驗,通過計算得出P=0.136(P>0.05),相關系數r=0.986。表明比對結果呈現較好的相關性數據支持,在檢測糞大腸菌群時可獲得兩種方法無顯著差異性,具有等效性、可比性的結論。結果比較如圖4所示。

表2 兩種方法檢測南寧市區污水處理廠污水樣品中的糞大腸菌群的結果

圖4 兩種方法檢測南寧市區污水處理廠污水樣品中的糞大腸菌群的對數結果比較

試驗結果表明,酶底物光譜法在檢測不同類型的實際樣品時,與酶底物法作為對照,檢測結果一致、等效,可有效檢測水中總大腸菌群、大腸埃希氏菌及糞大腸菌群,可作為檢測新方法。

2.2 酶底物光譜法對有證質控樣品的檢測

酶底物光譜法對有證質控樣品的檢測結果如表3所示。結果表明:總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群的檢測結果均在質控樣品的參考值范圍內,酶底物光譜法可以準確檢測定量質控。

表3 酶底物光譜法檢測定量質控樣品的結果

2.3 方法比對

(1)在檢測時長、結果報告方面,酶底物光譜法更有效率。酶底物法的培養時間為24～28 h,培養

時間固定,人工計數查MPN表報告結果;酶底物光譜法是快速法,培養時間為2～18 h,檢測儀運用樣品酶反應產生熒光強度的時間與目標細菌濃度建立標準曲線,自動控制培養時間,大腸桿菌大于1×106CFU/(100 mL)的高污染樣品檢測時間短,最快2 h,大腸桿菌小于1 CFU/(100 mL)的樣品檢測需18 h。檢測儀自動報告結果,可以聯網發送結果到手機,無需人員值守實驗室等待,提高了工作效率的同時降低人工計數誤差,可滿足提前預警降低危害、及時提示風險的功能需求,滿足應急快速檢測的需求。

(2)酶底物光譜法在檢測時水樣不受渾濁度、色度的影響。由于酶底物光譜法所使用的化學培養基是一種疏水性試劑,當發生反應時,熒光分子作為指示劑快速地從水樣中移動到套筒內的聚合物光學傳感器中,由系統中的微型光譜儀自動完成檢測。因此,可以避免來自水樣中懸浮物、雜質、水樣本底顏色等的干擾。用酶底物法檢測樣品,其渾濁度、色度較高時,存在一定的干擾,需要做樣品本底對照,在結果計數時輔助辨別顏色。

(3)酶底物光譜法在無需稀釋水樣時,具有更寬的測量范圍。酶底物法的測量值為1～2 419.6 MPN/(100 mL),酶底物光譜法的測量值為1～1×108CFU/(100 mL),后者可減少稀釋次數,降低稀釋誤差。

(4)酶底物法可用于實驗室常規檢測、應急檢測,能滿足大批量樣品的微生物檢測需求。酶底物光譜法的檢測儀是集合樣品培養和檢測功能的一體機,配置有16個樣品位置,適合檢測樣品批量和數量少的實驗室。

(5)酶底物光譜法比酶底物法在操作上進一步提升便捷性和效率,但其檢測儀器、耗材成本也更高。市場上同類型酶底物光譜法檢測儀有臺式儀器和便攜式儀器,其價格是酶底物法設備的3～6倍,其單個耗材費用為酶底物法的1～2倍。

3 結論

(1)試驗測定不同類型的實際水樣中的總大腸菌群、大腸埃希氏菌及糞大腸菌群指標,檢測結果統計分析表明酶底物光譜法與酶底物法無統計學意義上的顯著性差異。由于比對的樣本數量不夠多,比對結果亦存在一定的局限性。

(2)酶底物光譜法可以準確檢測以上3項水質糞便污染指示菌。

(3)酶底物光譜法已經列入山東省地標《水質 糞大腸菌群測定 光度法》(DB 37/T 3787—2019),暫未列入國家其他水質標準中。此外,該方法檢測成本相對較高,因此,在實驗室開展常規檢測時通常不會作為首選方法,但是有條件的實驗室可將其列為傳統檢測方法(如多管發酵法、濾膜法)的比對方法,作為國標檢測方法的有益補充,豐富和完善實驗室的多元化檢測方法體系。

(4)酶底物光譜法具有操作步驟簡易、檢測效率高、無需稀釋條件下測定范圍較寬、方便攜帶及遠程傳輸數據等優點,在應急突發事件現場檢測、風險預警方面具有較強的應用前景和優勢。