基于PI3K-AKT-mTOR信號通路探討靈芝孢子對2型糖尿病大鼠睪丸的保護作用①

逄瑞豐,王肖燁,宣金雨,畢九丁,孔維明,郝婉瑩,馬小茹

(佳木斯大學醫學部,黑龍江 佳木斯 154007)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種全身性、慢性、代謝性疾病,由遺傳因素和環境因素長期共同作用所導致。我國糖尿病患者人數位居世界榜首且有年輕化趨勢[1],糖尿病可導致機體代謝紊亂從而產生許多并發癥,有研究表明,糖尿病患者都會出現不同程度的生殖系統障礙,如性欲下降、精液質量下降、勃起功能障礙、逆行射精等[2]。因此糖尿病導致的男性不育問題也逐漸被人們廣泛關注。睪丸是雄性生殖器官之一,是精子產生的場所,睪丸的健康與精子質量息息相關,其對男性生殖功能極為重要。

PI3K-AKT-mTOR通路是人體調節細胞周期重要通路之一,在細胞存活、增殖和蛋白質合成中起重要作用。在調控男性生殖系統方面也發揮著重要的作用,其不僅參與影響下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸功能[3],還通過調節精原細胞的增殖分化、精母細胞的減數分裂、精子的發生和睪丸體細胞的功能來影響精子發生的過程[4]。同時該通路也可以在自噬與凋亡的調控中來維持睪丸生精微環境的穩態[5,6]。有研究表明,2型糖尿病通過激活PI3K-AKT信號通路,降低了睪丸中血管內皮生長因子(VEGF)的表達,破壞睪丸微循環導致了睪丸形態改變、細胞凋亡水平異常和精子發生障礙[7]。

靈芝孢子是靈芝噴射出的生殖細胞即靈芝的種子,其有靈芝多糖、靈芝三萜等有效成分,具有降脂降糖、提高免疫力、抗炎癥和抗氧化等多種功效,是被人們廣為運用的保健品之一。有研究表明,靈芝孢子對糖尿病可以起到預防作用,同時也對多種糖尿病的并發癥如糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病足等具有較好的治療作用[8]。在糖尿病男性生殖功能障礙方面,靈芝孢子可以通過調節氧化應激和改善線粒體損傷來改善糖尿病大鼠的勃起功能障礙[9],因此,使用靈芝孢子改善男性生殖功能障礙前景可觀。

靈芝孢子對人的體細胞與生殖細胞的DNA均有保護作用,但靈芝孢子是否通過PI3K-AKT-mTOR通路對2型糖尿病導致的睪丸損傷有保護作用尚未發現有關報道,因此本實驗通過建立2型糖尿病大鼠模型,靈芝孢子灌胃干預,觀察2型糖尿病對大鼠睪丸的損傷作用以及靈芝孢子對其的保護作用,并探討可能機制,為發掘靈芝孢子潛在藥用價值及治療男性不育提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:清潔級雄性SD大鼠40只,體質量170～220g,購自哈爾濱醫科大學動物實驗中心(實驗動物許可證號:SYXK(黑)2016-014),飼養于佳木斯大學實驗動物中心,溫度(24±2)℃,濕度40%～60%,每日日照12h,自由飲食飲水。本實驗方案通過佳木斯大學動物實驗倫理委員會批準,編號為 No.216-JMSU。

1.1.2 主要試劑與藥品:STZ購自Sigma公司;靈芝孢子購自上海源葉生物科技有限公司;磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)抗體、磷酸化磷脂酰肌醇 3-激酶(p-PI3K)抗體購自英國Abcam公司;絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)抗體、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶(p-AKT)抗體、雷帕霉素受體蛋白(mTOR)抗體、磷酸化雷帕霉素受體蛋白(p-mTOR)抗體購自美國CST公司;SOD、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模:40只雄性SD大鼠適宜溫度、濕度適應性飼養1周后開始實驗,隨機分為正常(NC)組(n=10),高脂高糖飲食(HF)組(n=10),糖尿病(DM)組(n=10),靈芝孢子干預(GLSP)組(n=10)。高脂高糖飼料(配方:基礎飼料粉末:白砂糖:豬油:蛋黃=59:20:17:4)喂養HF組、DM組、GLSP組,喂養4周后DM組、GLSP組禁食12h,腹腔注射STZ(30mg/kg),隨后分別在第3、7天檢測大鼠空腹血糖(FBG),若連續兩次FBG≥16.8mmol/L則造模成功,首次造模不成功以STZ(15mg/kg)進行二次補注,造模成功后GLSP組以靈芝孢子300mg/(kg·d)灌胃共計12周,NC組、HF組、DM組以等量生理鹽水灌胃連續12周。

1.2.2 各組大鼠標本留取:飼養期間每日觀測各組大鼠精神狀態、飲食飲水情況、毛色變化、尿量。每周測定一次FBG與體質量,在末次給藥后禁食12h再測定一次FBG,實驗結束后腹腔注射3%戊巴比妥鈉45mg/kg溶液麻醉處死大鼠,取血于-80℃保存備用,分離兩側睪丸,冰生理鹽水沖洗、濾紙拭干后稱重,保存于-80℃冰箱。整個過程均在冰上操作。

1.2.3 各組大鼠精子形態觀測:大鼠麻醉處死后取附睪尾置于裝有4mL,37℃的EP管中剪碎,使精子充分游出,再將懸濁液置于65℃水浴鍋內10min消除精子活性,取精子懸濁液涂片、干燥、固定、染色。低倍鏡下觀察視野內精子密度,高倍鏡下觀察精子形態。

1.2.4 SOD與MDA測定:取睪丸組織,充分剪碎研磨離心制備組織勻漿,以試劑盒說明書為準分別進行SOD與MDA檢測操作,使用酶標儀測定并記錄OD值。

1.2.5 Western bolt法檢測蛋白表達水平:取出保存于-80℃冰箱的睪丸組織置于冰盒上,稍微解凍后剝離組織外膜及周圍脂肪,稱量0.1g置于1.5mL離心管中并加入組織裂解液1mL、10μL蛋白酶抑制劑,用眼科剪剪碎,置于玻璃研磨器中充分研磨后使用細胞超聲破碎機進行超聲破碎5次,置于4℃靜置1h。于離心機以4℃、15000r離心15min取上清,BCA法測蛋白濃度。按比例加入蛋白上樣緩沖液(6×buffer),100℃沸水浴10min。制膠、上樣(30μg/孔)后進行電泳(恒壓80V至maker出紅線后轉換恒壓120v)、轉膜(恒流260mA)、實驗級脫脂奶粉封閉(37℃,1.5h)、TBST洗凈后分別加入PI3K(1:1000)、p-PI3K(1:1500)、AKT(1:1500)、p-AKT(1:1000)、mTOR(1:1500)、p-mTOR(1:1500)抗體4℃孵育過夜,洗凈后加入對應二抗,ECL顯色法檢測大鼠睪丸組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達情況,再用image1.8.0軟件分析條帶光密度值。

1.3 主要觀察指標

各組大鼠體質量及睪丸質量、空腹血糖、精子形態、睪丸組織氧化應激水平,PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達情況。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 受試實驗動物數量分析

實驗共選用40只雄性SD大鼠,分為正常組、高脂高糖飲食組、糖尿病組、靈芝孢子干預組,每組10只。在復制2型糖尿病模型期間,糖尿病組有1只大鼠死亡,可能與腹腔注射時針頭穿破腸道有關,最終共計39只大鼠進入結果分析。

2.2 各組大鼠狀態

NC組大鼠在整個實驗過程中精神飽滿,飲食飲水情況正常,毛色順滑,活動情況正常,尿量正常。HF組大鼠前期情況與NC組無較大差距。實驗中后期,該組大鼠體型碩大,飲食飲水較多,毛發粗糙,活動情況不佳。DM組大鼠體型瘦小,毛色暗黃粗糙且沒有光澤,飲水情況增加,尿量增加,呈現典型的“三多一少”狀態,反應遲鈍,精神萎靡。GLSP組大鼠情況較DM組有所改善,尿量減少,精神狀態尚可。

2.3 各組大鼠末次FBG情況

結果顯示,與NC組及HF組相比,DM組大鼠血糖值顯著升高(P<0.01),經靈芝孢子干預后,血糖值較DM組顯著降低(P<0.01),NC組與HF組血糖值無明顯差異(P>0.05)。提示靈芝孢子對糖尿病大鼠有顯著的降血糖效果,見圖1。

注:與正常組比較**P<0.01,與糖尿病組比較##P<0.01。

2.4 各組大鼠體質量及睪丸質量情況

結果顯示,DM組大鼠的體質量與睪丸質量明顯較NC組與HF組降低(P<0.01),經靈芝孢子灌胃干預后,GLSP組大鼠體質量及睪丸質量較DM組明顯升高,有明顯的統計學意義(P<0.01),見圖2。

注:與正常組比較**P<0.01,與糖尿病組比較##P<0.01。

2.5 各組大鼠精子形態

經染色后觀察發現,低倍鏡下NC組與HF組大鼠精子密集,DM組大鼠精子數目稀少,經GLSP干預后數目有所好轉。高倍鏡下觀察發現NC組與HF組大鼠有較多正常形態精子,DM組大鼠精子形態有較多異常,如斷頭、無頭、卷曲等,見圖3,4。

圖3 各組大鼠精子形態(100×)

圖4 各組大鼠精子形態(400×)

2.6 各組大鼠SOD、MDA情況

結果顯示,DM組大鼠SOD水平較NC組明顯降低(P<0.01),MDA水平明顯增高(P<0.01),經靈芝孢子干預后,GLSP組大鼠的SOD與MDA水平較DM組大鼠有明顯好轉(P<0.05,P<0.01),見圖5。

注:與正常組比較**P<0.01,與糖尿病組比較#P<0.05,##P<0.01。

2.7 Western boltting法檢測PI3k-Akt-mTOR信號通路蛋白表達水平

Western boltting結果顯示,DM 組大鼠睪丸組織 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和 pmTOR/mTOR 蛋白水平顯著高于 NC 組(P<0.01),HF 組大鼠睪丸 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 以及 p-mTOR/mTOR 蛋白水平顯著低于 DM組(P<0.01,P<0.05,P<0.01),有明顯統計學差異。經靈芝孢子治療后,GLSP組大鼠p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和 p-mTOR/mTOR 蛋白水平較DM組顯著降低(P<0.05)。可見靈芝孢子具有明顯的降低PI3K-AKT-mTOR信號通路蛋白磷酸化水平,見圖6。

注:與正常組比較**P<0.01,與糖尿病組比較#P<0.05,##P<0.01。

3 討論

縱觀全球,糖尿病發病率持續上升,我國糖尿病患病率也呈逐漸攀升趨勢[10],糖尿病所致的男性生殖障礙是當今關注的熱點。睪丸是男性重要的生殖器官,既往諸多臨床和動物實驗數據表明糖尿病會對睪丸造成損傷,降低男性生殖功能。靈芝孢子是靈芝的種子,主要包括多糖類、生物堿類、三萜類化合物、蛋白質,核苷和核苷酸等,具有抗糖、抗氧化、抗炎、抗衰老以及免疫調節、調控腸道菌群等藥理作用,是中醫藥中極為重要的藥用產品,具有很高的藥用和養生保健食療價值。

有研究發現,糖尿病是勃起功能障礙和其他男性性功能障礙的危險因素之一,影響著男性生殖系統的健康,與男性不育息息相關[11,12]。實驗結果顯示,DM組大鼠較NC組而言體質量、睪丸質量明顯降低,血糖明顯升高,且精神萎靡,反應遲鈍,尿量增多,體態消瘦。靈芝孢子灌胃干預后大鼠體質量和大鼠睪丸質量都增加,血糖下降,精神狀態逐漸有所恢復,毛色逐漸變淡,毛發逐漸順滑,尿量減少,活動增加,說明靈芝孢子發揮降糖作用且在糖尿病導致的睪丸損傷中起到積極方面作用。

精子的健康狀態可直接反應雄性生殖功能的水平,異常的精子形態會影響精子活動能力而導致受精失敗。在本實驗中可發現NC組與HF組的精子數目密集、高倍鏡下較大部分的精子形態正常,而DM組大鼠精子數目稀疏,高倍鏡下發現較大部分精子形態異常,出現無頭、斷頭、斷尾、卷曲等畸形現象,而經靈芝孢子干預后該現象有所好轉,說明糖尿病可直接影響精子的數目以及形態,而靈芝孢子可改善糖尿病導致的這一負面現象。

氧化還原平衡對于維持精子功能的各個重要方面至關重要,精子細胞膜含有大量的多不飽和脂肪酸,這使得它們對氧化損傷非常敏感[13],當抗氧化物的數量并不足以與其拮抗時會形成過氧化產物從而對機體造成傷害,導致膜完整性的喪失,DNA損傷,線粒體功能障礙,精子數量減少,活力下降等造成男性不育[14]。SOD是清除ROS的主要酶, MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一,其直接反應機體被自由基侵襲的程度。在本實驗中的結果顯示,與NC組相比DM組大鼠MDA含量顯著升高,SOD含量顯著下降。靈芝孢子灌胃治療后MDA含量下降,SOD含量上升,說明在DM狀態下,睪丸組織內部氧化應激水平增加,組織器官氧化損傷。靈芝孢子干預后大鼠睪丸組織內部氧化因子釋放減少,抗氧化物酶含量增加,提示靈芝孢子具有抗氧化的功能,可以保護糖尿病大鼠睪丸損傷與通過改善氧化應激水平存在顯著相關性。

PI3K/AKT/mTOR 通路被認為在調節葡萄糖攝取和糖原合成的胰島素信號通路中起關鍵作用[15]。于此同時,該通路也與精子發生成熟息息相關[16]。該通路是自噬的負調控軸,mTOR是該通路的下游蛋白[16],被譽為細胞自噬的抑制劑。一項研究[16]中發現通過STZ聯合高脂高糖飲食制備的糖尿病腎病模型中PI3K/AKT/mTOR 信號通路磷酸化蛋白表達水平顯著上調,自噬相關蛋白表達明顯下降,凋亡水平活躍,炎癥水平增高,出現了腎臟損傷和功能障礙,而在糖尿病睪丸損傷中尚未有相關報道。在本實驗中,DM組p-PI3k、p-AKT、p-mTOR水平較NC組顯著升高,表明該信號通路被激活,靈芝孢子干預后,p-PI3k、p-AKT、p-mTOR水平較DM組顯著下調,這提示著靈芝孢子對糖尿病睪丸起保護作用可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路進而重新激活自噬有關。

本實驗中HF組的血糖水平未明顯上升,但大鼠體質量明顯增加,氧化應激水平增加,且通過PI3K/AKT/mTOR 通路蛋白的檢測發現HF組與DM組之間依然有明顯差異。推測單純的高脂高糖飲食尚不能構成糖尿病模型,還需進一步探究討論。

綜上所述,本實驗利用靈芝孢子灌胃干預糖尿病大鼠,可以有效改善DM大鼠一般情況,降低DM大鼠血糖,增加DM大鼠體質量和睪丸質量,降低DM大鼠的氧化應激水平,降低DM大鼠p-PI3k、p-AKT、p-mTOR水平。靈芝孢子對DM睪丸損傷具有明顯保護作用,其機制可能與抑制 PI3K/AKT/mTOR 信號通路,降低氧化應激水平有關。