日本沼蝦樁蛋白基因的克隆與鎘脅迫對其表達的影響

彭佳誠,吳 越,徐潔皓,夏美文,齊天鵬,徐海圣,3,*

(1.浙江大學 動物科學學院,浙江 杭州 310058; 2.浙江萬里學院 生物與環境科學學院,浙江 寧波 315100; 3.浙江大學湖州市南太湖現代農業科技推廣中心,浙江 湖州 313000)

樁蛋白(paxillin, PXN)是近年來發現的一種信號蛋白,主要位于細胞與胞外基質的黏著斑內,是黏著斑蛋白的結合蛋白[1],廣泛參與黏著斑信號和激酶信號的傳導,在細胞外信號向細胞內轉導過程中起“腳手架”作用[2],調控細胞的存活、增殖、分化和遷移,在器官的發育、損傷和感染后修復過程中有重要作用[3-4]。目前關于鎘脅迫下PXN基因的相關研究較少,多聚焦于PXN基因在臨床腫瘤與癌癥中的作用[5]。

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)又稱為青蝦、河蝦,廣泛分布于我國東部和亞洲其他國家的淡水水域中[6],具有個體小、繁殖快、易飼養等特點,是研究水體重金屬生物毒理的較優選擇。鎘(cadmium, Cd)是一種廣泛存在于水環境中的生物非必需重金屬元素,可在生物體內積累[7],并可通過食物鏈進行富集[8],引起水生生物的急性或慢性中毒[9],造成畸變甚至死亡,是水環境中的主要污染物之一,已引起全球的關注[10]。研究表明,鎘可導致生物體的形態破壞、生化改變和生理功能障礙等,還可引起機體活性氧積累,從而導致生物功能和細胞結構受損[11]。

本文采用分子生物學方法從日本沼蝦肝胰腺組織中克隆了樁蛋白基因,并研究了鎘脅迫對其表達的影響,研究結果將有助于更好地了解鎘污染對日本沼蝦的分子毒性作用,為水環境鎘污染的生態風險預警和評估提供生物標志物選擇的基線信息。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

日本沼蝦購自浙江省杭州市某水產養殖公司,平均體重(1.97±0.72)g,平均體長(5.59±0.57)cm。實驗前暫養于配備循環水過濾系統的12 L塑料水桶中,用增氧泵充氧,水溫(20.9±0.7)℃,每隔24 h換水。暫養3 d后,隨機挑選健康且規格一致的個體備用。

1.2 RNA提取與cDNA合成

解剖后取肝胰腺組織,使用RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa Bio, JPN)提取總RNA,使用Nanodrop 2000分光光度計和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度和完整性,按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit (TaKaRa Bio, JPN) 試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA,置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 MnPXN基因克隆與序列分析

在本實驗室創建的日本沼蝦肝胰腺轉錄組中找到相應基因片段,利用Primer 5.0軟件分別設計MnPXN基因5′RACE和3′RACE特異性引物(表1),進行5′和3′末端巢式PCR擴增。PCR程序為94 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,30個循環。RACE實驗所用的試劑盒為RACE試劑盒SMARTer? RACE 5′/3′ Kit(TaKaRa,Cat. No. 634858),以F1/R1的擴增產物作為F2/R2的模板依次進行擴增;使用RACE試劑盒附帶的NuceloSpin Gel and PCR Clean-Up Kit試劑盒進行膠純化。PCR產物利用pMDTM19T Vector Cloning Kit試劑盒連接至pMD19-T載體,轉化大腸埃希菌后篩選陽性克隆,送杭州尚亞生物技術有限公司測序。利用生物信息學在線工具分析MnPXN基因,在NCBI上查找開放閱讀框,分析蛋白質結構,推導氨基酸序列,利用Clustal-Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行氨基酸序列比對,用Mega 5.0軟件構建系統進化樹。

表1 基因克隆所用引物

1.4 MnPXN的組織表達分析

用加入50%抗凝劑(檸檬酸24.98 mmol·L-1,檸檬酸鈉51.15 mmol·L-1,葡萄糖81.59 mmol·L-1,NaCl 20.53 mmol·L-1)的注射器從日本沼蝦游泳足基部的血腔處共抽取血淋巴500 μL,4 ℃、4 000 r·min-1離心5 min,棄上清,即為血細胞;再分別取其心臟、肌肉、神經、腸、肝胰腺、胃、鰓等組織,放入液氮中速凍并保存在-80 ℃冰箱中備用。

按照1.2節方法從組織中提取總RNA并反轉錄成cDNA。根據克隆的MnPXN序列,使用Primer Premier 5.0軟件設計qRT-PCR特異性引物(表1)。以β-actin基因為內參基因,使用LightCycler480Ⅱ(Roche,480Ⅱ)進行qRT-PCR,程序設置:95℃ 30 s,95℃ 15 s,60℃ 30 s,共40個循環。每個樣品重復檢測3次。

1.5 鎘脅迫對MnPXN mRNA表達的影響

通過預實驗獲得氯化鎘(99%,URChem,上海)處理日本沼蝦24 h和96 h的半致死濃度(LC50)分別為0.242 7 mg·L-1和0.027 7 mg·L-1。隨機選取450只健康日本沼蝦,平均分為6組,氯化鎘質量濃度分別為0.242 7 mg·L-1(24 h-LC50組)、0.121 4 mg·L-1(1/2 24 h-LC50組)、0.061 0 mg·L-1(1/4 24 h-LC50組)、0.030 0 mg·L-1(1/8 24 h-LC50組)、0.015 0 mg·L-1(1/16 24 h-LC50組)和0 mg·L-1(對照組),每組設置3個重復。日本沼蝦養殖于配備增氧泵和循環水過濾系統的120 L塑料水箱中,水溫(20.9±0.7)℃,暫養3 d,每隔24 h換水。于脅迫24 h后,解剖取肝胰腺。另隨機選取150只健康日本沼蝦,平均分為2組,實驗組加入CdCl2至終濃度為0.020 0 mg·L-1,對照組加入等量清水,每組設置3個重復。分別于0、3、6、12、24、48、72、96 h取樣,解剖取肝胰腺。按照1.2節方法從肝胰腺中提取總RNA,并反轉錄成cDNA。按照1.4節方法進行qRT-PCR實驗。

1.6 體內siRNA干擾

根據克隆的MnPXN基因序列,采用Promega公司的RNA干擾試劑盒T7 RiboMAXTMExpress RNAi System合成dsRNA,以綠色熒光蛋白(GFP)基因作為陰性對照。隨機選取100只健康日本沼蝦,平均分為2組,設置dsRNA-MnPXN注射組為實驗組,dsRNA-GPF為對照組,利用100 μL微量注射器將上述基因的dsRNA分別從日本沼蝦第四、五腹節肌肉注射至體內,每只注射50 μL。注射48、72 h后,每組分別隨機取5尾日本沼蝦,取其肝胰腺組織,以β-actin作為內參基因,利用qRT-PCR檢測的RNA干擾效率。RNA干擾48 h后,將dsRNA-MnPXN實驗組與dsRNA-GFP對照組分別置于含0.020 0 mg·L-1氯化鎘的水體中,每隔6 h分別統計對照組與實驗組日本沼蝦的死亡個體數,計算死亡率。

1.7 數據統計分析

用2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量,利用Origin8.0軟件的one-way analysis of variance(ANOVA)和t-test對所有實驗數據進行方差分析,結果表示為平均值±標準誤。當P<0.05時認為差異顯著(*),P<0.01時認為差異極顯著(**),P<0.001時認為差異極顯著(***)。

2 結果與分析

2.1 MnPXN基因序列分析

使用RACE技術克隆得到日本沼蝦MnPXN的cDNA,其序列全長為3 655 bp(NCBI GenBank, MN728558),包括1 491 bp的編碼區,235 bp的5′非編碼區,1 885 bp的3′非編碼區和44 bp的poly(A)尾。MnPXN基因編碼496個氨基酸,蛋白質分子量為54.02 ku,等電點為5.07,N末端無信號肽,具有6個低復雜區域(low complexity)和3個保守的LIM結構域,LIM結構域分別位于第311～362個氨基酸、第370～421個氨基酸和第429～480個氨基酸(圖1)。Phyre 2在線軟件分析發現,蛋白質的三級結構存在12%的α螺旋結構和15%的β折疊結構。

Clustal-Omega在線比對分析發現,MnPXN與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、家蠶(Bombyxmori)、智人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、斑馬魚(Daniorerio)的PXN序列高度保守,其中智人、小鼠、斑馬魚、凡納濱對蝦有4個LIM結構域,而日本沼蝦、家蠶只有3個LIM結構域。用neighbor-joining(NJ)法構建了系統進化樹,結果顯示,MnPXN與甲殼動物(凡納濱對蝦)聚成一支,與昆蟲(家蠶、赤擬谷盜)的親緣關系較近,其次是魚類(斑馬魚)、鳥類(原雞)、兩棲類(高山倭蛙、非洲爪蟾)、哺乳類(小鼠、智人),與線蟲(秀麗隱桿線蟲)親緣關系最遠(圖2)。

圖2 MnPXN與其他物種PXN蛋白的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of MnPXN with PXN protein from other species

2.2 MnPXN基因的組織表達特征

qRT-PCR結果顯示,MnPXN基因在日本沼蝦的心臟、肌肉、神經、腸、血細胞、肝胰腺、胃和鰓8種組織中均有分布,其中在肝胰腺、胃、鰓中表達水平較高,在心臟和肌肉中表達水平較低(圖3)。

“*”表示表達水平與心臟組相比差異顯著(P<0.05);“**”表示差異極顯著(P<0.01);“***”表示差異極顯著(P<0.001).“*” indicates that the expression level of this group is significantly different from that of the heart group (P<0.05); “**” indicates significant difference at 0.01 level; “***” indicates significant difference at 0.001 level.

2.3 鎘脅迫對MnPXN基因表達的影響

分別用0.242 7、0.121 4、0.061 0、0.030 0、0.015 0 mg·L-1CdCl2脅迫日本沼蝦24 h后,其肝胰腺中MnPXN基因表達水平較對照組均顯著升高,其中0.061 0 mg·L-1CdCl2和0.030 0 mg·L-1CdCl2處理的MnPXN基因表達水平最高,極顯著(P<0.001)高于對照組;0.121 4、0.015 0 mg·L-1CdCl2處理的MnPXN基因表達水平次之,也極顯著(P<0.01)高于對照組;0.242 7 mg·L-1CdCl2處理的MnPXN基因表達水平顯著(P<0.05)高于對照組(圖4-A)。

“*”表示差異顯著(P<0.05);“**”表示差異極顯著(P<0.01);“***”表示差異極顯著(P<0.001)。下同。“*” indicates significant difference at 0.05 level; “**” indicates significant difference at 0.01 level; “***” indicates significant difference at 0.001 level. The same as below.

用0.020 0 mg·L-1CdCl2(亞致死濃度)脅迫日本沼蝦,脅迫6 h后MnPXN基因表達水平顯著升高,24 h表達水平達到最高,極顯著(P<0.001)高于對照組,隨后逐漸下降,脅迫96 h時,MnPXN基因表達水平與對照組差異不顯著(P>0.05)(圖4-B)。

2.4 體內RNA干擾

RNAi持續48 h和72 h后,MnPXN基因mRNA表達水平均較GFP顯著下降(P<0.05),(圖5-A),表明dsRNA對MnPXN基因的干擾是有效的。注射dsRNA-MnPXN實驗組日本沼蝦的死亡率顯著(P<0.001)高于注射dsRNA-GFP組,且于干擾后72 h全部死亡(圖5-B)。

圖5 RNA干擾對MnPXN基因表達和日本沼蝦存活率的影響Fig.5 Effect of RNA interference on MnPXN gene expression and survival rate of Macrobrachium nipponense

3 討論

PXN是一種信號轉導銜接蛋白,主要位于黏著斑處,參與細胞附著、擴散和遷移所需的黏著斑的組裝和拆卸,在整合素與細胞外基質結合后觸發的細胞外信號轉導到細胞內的反應中起重要作用[1,2]。目前,PXN的同源基因在智人(H.sapiens)、小鼠(M.musculus)、斑馬魚(D.rerio)等物種中被克隆出來[12-14],在一些模式動物如黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的高通量測序中被報告[15],但在水生甲殼動物中尚未見報道。

本研究中,我們克隆得到了日本沼蝦PXN基因(MnPXN)的cDNA序列,其全長為3 655 bp,編碼496個氨基酸,蛋白質序列中含有6個低復雜區域和3個保守的LIM結構域。不同物種PXN的LIM結構域數目不同,日本沼蝦、家蠶有3個LIM結構域,而智人、小鼠、斑馬魚和凡納濱對蝦含有4個LIM結構域。LIM結構域是高度保守的鋅指結合、半胱氨酸富集的基序,含有2個串聯的重復鋅指,不僅介導樁蛋白定位于黏著斑,而且介導多種蛋白質之間的相互作用[16]。同源性比對及系統進化樹結果顯示,MnPXN與凡納濱對蝦相似度達到79%,與同為節肢動物門的昆蟲如家蠶、赤擬谷盜的同源性為62%,與脊椎動物中的哺乳類、鳥類、兩棲類、魚類的同源性也達到了57%以上,表明PXN蛋白在進化上高度保守,物種之間具有高度同源性。

肝胰腺作為甲殼類體內重要器官,參與體內消化、貯存、分泌促生長物質、解毒與免疫等多種生理功能[17]。0.015 0 mg·L-1CdCl2處理24 h,日本沼蝦肝胰腺MnPXN基因轉錄水平較對照組顯著升高,0.061 0～0.242 7 mg·L-1CdCl2處理24 h后MnPXN轉錄水平呈下降趨勢,但均顯著高于對照組,表明日本沼蝦肝胰腺MnPXN基因能夠感知水體低濃度鎘離子刺激,而且其響應模式與脅迫時間相關。在亞致死濃度鎘脅迫96 h后,肝胰腺中MnPXN的mRNA水平出現先上調后下調的趨勢,于6 h開始顯著高于對照組,并于24 h達到最高值,96 h恢復至起始水平,與對照組差異不明顯,表明在此濃度下脅迫24 hMnPXN響應最強烈,后續的脅迫過程使該組織逐漸適應了一定濃度的鎘離子環境。

為更好地理解鎘脅迫對MnPXN基因的影響,以GFP基因作為陰性對照,進行了MnPXN基因的RNA干擾實驗,結果表明,肌肉注射MnPXN特異雙鏈RNA后,日本沼蝦肝胰腺中MnPXN基因表達水平顯著降低。MnPXN基因沉默后,用0.020 0 mg·L-1CdCl2脅迫72 h,日本沼蝦死亡率達到100%,而GFP對照組死亡率為36%,差異極顯著。已有研究表明,鎘脅迫可誘導細胞產生活性氧(ROS),過量的ROS導致脂質過氧化等氧化損傷[18]。脅迫下MnPXN基因表達水平呈在低濃度時升高、在高濃度時下降的特點,引起這種現象的原因可能是輕度應激引發刺激或有益的反應[19],而重度應激抑制了基因表達并對組織造成損傷或致使細胞壞死[20]。本實驗中,0.015 0 mg·L-1CdCl2脅迫就能引起MnPXN基因表達水平上調,表明MnPXN基因可作為日本沼蝦受水體中鎘脅迫的敏感生物標志物。