卟啉殼聚糖共聚物的合成及其光動力抗腫瘤性能

何裕良,鄭嘉琪,劉秋裕,莫雅通,梁惠婷,袁安琪,史 蕾*,張 召

(1.廣東第二師范學院 化學與材料科學學院,廣東 廣州 510800; 2.江西師范大學 國家單糖化學合成工程技術研究中心,江西 南昌 330022 3.廣東醫科大學 生物化學與分子生物學教研室,廣東 湛江 524023;)

光動力療法(Photodynamic therapy,PDT)是一種新興的治療方法,其原理是在特定光源的激發下,光敏劑從基態躍遷至第一激發態,通過系間躍遷至三重激發態,從而產生具有強氧化性的活性氧(ROS)或單線態氧(1O2),進而殺死腫瘤細胞[1-2]。研究發現:PDT主要通過直接殺傷、使血管閉合進而使腫瘤細胞缺氧、激活T細胞引發免疫反應3種方式來對腫瘤細胞進行殺傷[3]。PDT有著組織選擇性良好、創傷小、毒性低和靈活性好等優點,成為治療惡性腫瘤和微生物感染的新型療法[4]。

卟啉類化合物是一種具有18π電子的大共軛骨架的大環分子,π電子易在環內流動,因而表現出獨特的物理化學及光化學性質[5],有著分子催化[6]、光捕捉[7]和電子轉移[8]等功能,在催化化學、分析化學[9]、藥學[10]、光電化學[11]和分子器件[12]等領域有著廣泛的應用前景,是一種理想的光敏劑。

KELLY等[13]在1976年首次用一種血卟啉衍生物成功治療5例膀胱癌。經過近半個世紀的發展,卟啉類化合物已經在臨床上得到應用。2001年,美國食品與藥品監管局批準維替泊芬(苯并卟啉衍生物單酸環A)用于治療黃斑變性[14],由我國第二軍醫大學研制的血卟啉單甲醚已應用于腦膠質瘤和鮮紅斑痣的臨床治療[15]。華卟啉鈉(DVDMS)可用于治療晚期食管癌,是我國最早進入光動力抗腫瘤治療臨床研究的光敏劑,目前已經到了III期臨床試驗階段[16-17]。雖然PDT已經得到了學術界的廣泛關注,但光敏劑數量較少的問題對PDT的發展造成了很大的限制[18],因此,需要開發更多的光敏劑以推動PDT的基礎研究和臨床應用。

目前,光敏劑已經發展到了第三代,其設計思路主要是引入具有生物活性的分子,如糖、蛋白質和納米粒子等,從而增強光敏劑的生物相容性、水溶性和靶向性等性能,進而增強其PDT效力[19]。張海元等[20]通過熱收縮高分子[P(NIPAM-co-AM)]將鋅卟啉(ZP)連接于Bi2S3納米棒表面,形成BPZP和ZP可削弱細胞抗氧化的能力,進而增強PDT效力。劉筱陽等[21]將一種凋亡蛋白酶—半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的多肽底物DEVD與卟啉結合,提升了光敏劑的光敏活性,能誘導細胞更深度的凋亡。同時,因為凋亡蛋白的存在,在經過光/藥物誘導后,卟啉光敏劑能更為集中地聚集在線粒體的周圍,組織選擇性得到改善,實現對口腔癌細胞的協同殺滅。姜建壯等[22]設計了一種具有良好生物相容性和光活性的納米粒子(NPs),其由氨基卟啉(m-TAPP)與短肽(Fomc-L3-OMe)共組裝形成,NPs在低pH值的腫瘤微環境中帶正電,可與帶負電的癌細胞核糖體靶向結合,從而在腫瘤干細胞(CSC)中擴散,在光照條件下實現對CSCs的靶向殺傷。

羧甲基殼聚糖(CMC)是一種天然的兩性聚電解質多糖,有著良好的生物相容性、生物降解性和低毒性[23-25],其羧基和氨基賦予了其接枝其它分子的可能,通過化學修飾等手段,可在保留其良好的生物相容性等優點的同時賦予其新的性能,是一種理想的藥物載體[26],在藥物研發方面有著可觀的發展前景。

基于第三代光敏劑的設計思路,本文采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)組成的EDC/NHS體系,催化5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(TAPP)與CMC通過酰胺鍵結合,使二者發揮各自的優勢,以增強PDT效力。采用UV-Vis、IR、XRD與TGA表征化合物的結構,采用SEM觀察化合物的微觀結構,并測試了其光動力抗腫瘤性能。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津UV-Vis 2450型紫外可見分光光度計;布魯克Aensor 27型傅里葉紅外光譜儀;布魯克Advance型X射線衍射儀;鉑金埃爾默TGA 4000型熱重分析儀;泰思肯mira 3型場發射掃描電鏡;光照培養箱(LED光源,光照度4000 Lux)。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺(98%),阿拉丁;羧甲基殼聚糖,源葉生物;5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(98%),吉林中科研伸科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺、無水乙醇、二甲基亞砜,分析純,天津市大茂化學試劑廠;肝癌HepG2細胞、肝癌MHCC-97L細胞,American Type Culture Collection。

1.2 合成

稱取0.0011 g的CMC于50 mL離心管中,加入0.016 mmol·L-1的EDC溶液和0.004 mmol·L-1的NHS溶液各1 mL,待CMC充分溶解后,磁力攪拌30 min進行活化。稱取0.0067 g的TAPP,用1 mL的DMF溶解后滴入活化完成的CMC溶液中,然后在避光條件下磁力攪拌反應48 h,得到難溶于水、DMF和乙醇的絮狀物。用無水乙醇洗滌絮狀物,在4000 r/min的轉速下離心,再吸出上層洗液,直至上清液呈淺黃色,且洗液在365 nm的紫外燈照射下僅存淡淡熒光,用紫外可見光譜檢測,直至不出現TAPP的吸收峰。最后在真空干燥箱中常溫且避光去除殘余洗液[27-28]。合成路線如圖1所示。UV-Vis(DMF∶EtOH=1∶1,V∶V)λmax:432,524,570,600 nm; IR(KBr)ν:3421,3354,3215,2950,1670,1610,1400,736 cm-1。

圖1 TAPP-CMC的合成路線

1.3 光動力抗腫瘤活性測試

實驗細胞為HePG2細胞,MHCC-97L細胞,以及HK2細胞。孔板中分布有2×105個細胞,將其置于培養箱中培育12 h。吸取培養基,加入TAPP-CMC懸濁液,在5 W、625 nm的紅光下照射1 h,光照距離為15.5 cm。對照組細胞不做處理。培養23 h后棄去培養基,用PBS洗滌細胞3次,最后于倒置熒光顯微鏡中觀察并對比細胞形態。

2 結果與討論

2.1 化合物的表征分析

(1) 紫外光譜分析

如圖2所示,卟啉類化合物在300～400 nm會出現明顯的Soret吸收,500～700 nm的Q帶也有較弱的吸收。用(EtOH∶DMF=1∶1,V∶V)作為溶劑,觀察TAPP和TAPP-CMC的紫外譜圖可發現,TAPP-CMC的最大吸收峰出現在432 nm處,在500～700 nm處也出現了Q帶的吸收,相對于TAPP未發生顯著變化,但吸收強度大幅降低,這表明CMC的引入沒有破壞卟啉環的共軛結構,二者結合后可能發生了電子轉移。

λ/nm

(2) 紅外光譜分析

采用KBr壓片法對CMC、TAPP和TAPP-CMC進行紅外光譜表征,結果如圖3所示。CMC的-NH2中的N—H鍵的伸縮振動峰出現在3400 cm-1,1606 cm-1、1419 cm-1和1060 cm-1分別對應-COOH的C=O鍵、C—O鍵和O—H鍵的伸縮振動峰[29-30]。TAPP的-NH2的對稱和不對稱伸縮振動峰分別出現在3448 cm-1和3427 cm-1,卟啉環的N—H鍵的特征峰出現在3300 cm-1和966 cm-1,N—H鍵的彎曲振動峰和搖擺振動峰分別出現在1604 cm-1,804 cm-1處對應-NH2的搖擺振動峰[31-33]。

ν/cm-1

在TAPP-CMC的紅外譜圖中,原本出現在1060 cm-1處的-COOH的伸縮振動峰消失,在3421～3354 cm-1出現了酰胺I帶伸縮振動峰,3215 cm-1處為N—H鍵的伸縮振動峰,1670～1610 cm-1出現了酰胺II帶的伸縮振動峰,1400 cm-1附近出現了C—N鍵的伸縮振動吸收帶,在736 cm-1附近出現了伯酰胺的搖擺振動吸收寬峰。由此可推斷,CMC與TAPP通過酰胺鍵結合。

(3) 熱重分析

通過熱重分析來表征化合物的熱穩定性。圖4為CMC、TAPP和TAPP-CMC的TG和DTG曲線。CMC的熱穩定性較差,其熱重分析過程存在3個失重過程,第1個階段是30～240 ℃,對應吸附水和結合水的散失;第2個階段是240～320 ℃,其失重速率和失重均為最大,應為分解階段;第3個階段是320～530 ℃,失重較為緩慢。530 ℃時基本不再失重。800 ℃下的失重率為35.30%。TAPP具有較好的熱穩定性,僅在450～690 ℃出現了明顯的失重,800 ℃的失重率為40.00%。

Temperature/℃

2θ/(°)

TAPP-CMC的熱穩定性介乎TAPP和CMC之間,熱失重行為與TAPP相似,出現在330～510 ℃。結果表明:TAPP與CMC通過酰胺鍵結合,CMC的引入沒有破壞卟啉的大環結構。

(4) XRD分析

對CMC、TAPP和TAPP-CMC進行X射線粉末衍射表征,結果如圖5所示。CMC在2θ為21.8°、17.3°、20.0°、20.09°和34.7°分別出現了特征峰。TAPP在20°時出現了較寬的特征峰,這表明二者均有一定的晶體結構。TAPP-CMC的衍射峰不僅保留了CMC的特征峰,也保留了TAPP20°的較寬的特征峰,說明TAPP與CMC的結合均保留了各自的規整結構,二者的結合通過酰胺鍵的生成來實現[32]。

(5) SEM分析

圖6為CMC和TAPP-CMC的掃描電鏡圖。CMC主要呈現出不規則的碎片形貌,粒徑尺寸為100 μm～700 μm。TAPP-CMC主要呈現不規則的塊狀碎片,粒徑尺寸為4.5 μm～350 μm。

圖6 CMC(a,b,c)和TAPP-CMC(d,e,f,g)的SEM照片

2.2 光動力抗腫瘤活性分析

圖7為加藥后HePG2、MHCC-97L以及HK2的細胞形態變化圖。在加藥后,細胞形狀變得不規則,開始逐漸皺縮,說明細胞呈現出凋零的態勢。結果表明:TAPP-CMC對肝癌HePG2和MHCC-97L細胞均具有光動力抗腫瘤的活性。此外,TAPP-CMC對肝正常細胞HK2也具有一定的光動力抗腫瘤的活性,說明其光敏副作用也存在。

圖7 加入TAPP-CMC藥液并給予光照培養后HePG2、MHCC-97L以及HK2的細胞形態變化

3 結論

基于第三代光敏劑的設計思路,本課題設計了一種卟啉-殼聚糖共聚物,用UV-Vis、FT-IR、XRD和TGA表征化合物的結構,用SEM觀察了其微觀形貌,通過觀察腫瘤細胞形態圖研究了該化合物的光動力抗腫瘤活性。結果表明:設計出了一套可行的卟啉-殼聚糖共聚物的合成方案,利用相關表征證明該合成方案能合成出目標化合物;首次發現TAPP-CMC共聚物具有一定的光動力抗腫瘤活性;通過對比發現,TAPP與CMC的結合保持了二者的主要結構,有利于二者發揮各自的優點。基本符合分子設計的初衷,為新一代光敏劑的開發提供實驗依據和理論參考。