金線蓮提取物對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

朱亮 包曉君 王群星 徐菲拉

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指除心源性外的各種直接或間接因素所致的肺組織結(jié)構(gòu)特征性病理改變而出現(xiàn)的臨床綜合征，年死亡率達(dá)30%～40%，是臨床常見危重癥[1]。目前ALI 尚無有效的治療方法，患者預(yù)后并不理想。ALI發(fā)病機(jī)制仍未確切闡明，失控性炎癥反應(yīng)或是ALI病情進(jìn)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。細(xì)胞因子和炎癥趨化因子因肺內(nèi)炎癥細(xì)胞過度活化、募集，在短時間內(nèi)形成級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，導(dǎo)致廣泛肺上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最終造成ALI的發(fā)病及發(fā)展[3]。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要毒性成分，可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，引起一系列的前炎因子釋放，進(jìn)而誘發(fā)ALI，其誘導(dǎo)的體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ团c臨床ALI 高度相似[4]。相較于腹腔注射LPS 的動物模型，鼻腔滴入LPS 誘導(dǎo)ALI 體內(nèi)模型可更好地模擬ALI 的發(fā)病過程與機(jī)制[5]。金錢蓮為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是民間珍貴的中藥材，具有較明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血壓等藥理作用，并已廣泛應(yīng)用于臨床[6-10]。但金線蓮對ALI的藥理作用尚未見報道。本研究采用LPS 鼻腔滴注構(gòu)建小鼠ALI 模型，觀察金線蓮對該模型的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 60 只SPF 級雄性ICR 小鼠，體質(zhì)量25～30 g，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.2 藥物與試劑 金線蓮由浙江金華天寧堂生物科技公司提供，經(jīng)金華市中心醫(yī)院徐菲拉主任醫(yī)師鑒定為Anoectochilus formosanus Hayata。金線蓮提取物的配置：取金線蓮生藥64 g，加水1 000 mL 浸泡2 h，煎煮4 h，藥液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至160 mL 作為高劑量組（生藥濃度0.4 g/mL），梯度稀釋成中（0.2 g/mL）、低劑量（0.1 g/mL），備用；按70 kg 成人體重計算，成人給藥劑量為0.285 g/kg，根據(jù)人與動物間體表面積折算的等效劑量比值[11]，換算為本實驗小鼠給藥劑量：高劑量為5.200 g/kg，中劑量2.600 g/kg，低劑量為1.300 g/kg。LPS購于美國Sigma公司，批號為153963，使用時稱取0.8 mg，用0.9%氯化鈉溶液溶解定容至2 mL，4 ℃冰箱保存。

地塞米松粉劑購于上海源葉生物科技有限公司，批號：H07N9Z74419，使用時稱取2.5 mg，用0.9%氯化鈉溶液溶解定容至4 mL，4 ℃冰箱保存。人核因子κB抑制蛋白α（I-kappa-B-alpha，IκBα）抗體、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）抗體均購于美國Proteintech公司，批號為00056584 和00045155；磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular signalregulated kinase，p-ERK）抗體、β 肌動蛋白（β-actin）和磷酸化IκBα（phosphorylated IκBα，p-IκBα）購于美國Affinity 公司，批號為56o9874、12w2944 和68m1458；小鼠IL-6 ELISA 試劑盒、小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）ELISA 試劑盒、小鼠IL-12/p70 ELISA 試劑盒、小鼠IFN-γ ELISA試劑盒、小鼠TNF-α ELISA 試劑盒、小鼠IL-10 ELISA試劑盒均購于江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號分別為MM-46428M1、MM-0082M1、MM-0174M1、MM-0182 M1、MM-46435 M1、MM-46420M1；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）抗體、p-ERK 抗體、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抗體、磷酸化JNK（phosphrylated JNK，p-JNK）抗體、p38抗體、磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）抗體、腺苷單磷酸活化蛋白激酶α（adenosine monophosphate activated protein kinase α，AMPKα）抗體、磷 酸 化AMPKα（phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase α，p-AMPKα）抗體、MPO抗體、山羊抗兔IgG 預(yù)吸附二抗均購買于美國Abcam公司，批號分別為GR3305911-2、GR1489866-8、GR70875 11-65、GR5455638-19、GR5455638-19、GR337 6466-11、GR0837100-56、GR40 28577-36、GR9346133-12、GR 3214733-25。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，批號為20220218。

1.3 ALI 模型的建立及分組處理 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為模型組、對照組、地塞米松組、金線蓮高、中、低劑量組，每組10 只。模型組、對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，地塞米松組給予地塞米松5.0 mg/kg 溶液腹腔注射，金線蓮高、中、低劑量組分別給予不同劑量（1.3、2.6、5.2 mg/kg）的金線蓮提取物灌胃，均為0.33 mL/只；連續(xù)給藥2 d[12]。48 h后用4%水合氯醛溶液按0.01 mL/g 腹腔注射麻醉小鼠，對照組給予0.9%氯化鈉注射液滴鼻，其余各組給予LPS 滴鼻，50 μL/只。4 h后，重復(fù)給藥1次。24 h后造模完成[13]。取LPS 處理過的小鼠頸椎脫臼處死，剝離肺組織制備石蠟切片，采用常規(guī)HE 染色法進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，以肺組織肺泡壁增厚，炎性細(xì)胞浸潤等病理變化判斷ALI 模型制備成功。隨后每組取5 只小鼠，頸椎脫臼處死；解剖并暴露支氣管及肺組織，使用0.9%氯化鈉溶液從支氣管內(nèi)注入肺部后吸出，沖洗3 次，獲得肺泡灌洗液；4 ℃3 000 r/min 離心10 min，收集上清液并分裝后置于-80 ℃冰箱保存，備用。解剖取肺組織，濾紙吸水后稱濕質(zhì)量并記錄；取部分左肺臟以10%甲醛固定，剩余左肺稱質(zhì)量。新鮮右肺置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 6 組小鼠肺組織病理學(xué)檢查 采用HE 染色法，顯微鏡下觀察各組小鼠組織病理變化。

1.4.2 6 組小鼠肺組織濕干比（wet/dry，W/D）的檢測取部分左肺組織，洗去殘留血液，用濾紙吸干表面水分后稱質(zhì)量，得到濕質(zhì)量（W）。隨后放入60 ℃烘箱內(nèi)烘48 h，再次稱質(zhì)量，得到干質(zhì)量（D），計算W/D。W/D 越大，表示肺組織的水腫程度越高。

1.4.3 6組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞因子的檢測 采用ELISA 法。按照相應(yīng)試劑盒說明，測定肺泡灌洗液中IL-6、MCP-1、IL-12/p70、IFN-γ、TNF-α和IL-10水平。

1.4.4 6 組小鼠肺組織中MPO、p-ERK、IκBα 和p-IκBα 蛋白表達(dá)水平的檢測 采用免疫組化法。取剩余左肺組織，按免疫組化試劑盒說明經(jīng)過脫臘、抗原修復(fù)后進(jìn)行免疫組化檢測。顯微鏡下觀察并拍照，棕黃色為陽性信號。應(yīng)用Image Pro Plus 軟件測量圖像的累積光密度值和區(qū)域面積值，以兩者比值確定肺組織中MPO、p-ERK、IκBα 和p-IκBα 蛋白表達(dá)水平。

1.4.5 6 組小鼠肺組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AMPKα、p-AMPKα、MPO 蛋白相對表達(dá)量檢測 采用Western bolt 法。取右肺組織裂解，根據(jù)BCA 定量檢測試劑盒方法檢測總蛋白。電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉，用TBST 洗膜3 次，10 min/次，將膜放入含ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AMPKα、p-AMPKα、MPO 一抗稀釋液的孵育盒中，4 ℃搖床振蕩孵育過夜；TBST 洗凈后，用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1～2 h，用TBST 洗凈后加入ECL 發(fā)光試劑充分接觸反應(yīng)3 min。凝膠成像儀成像后，chemi capture 軟件保存圖像，以β-actin 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析各蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組樣本間比較選用兩獨立樣本t檢驗，多組樣本間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6 組小鼠肺組織病理學(xué)觀察 對照組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，層次清晰，未見明顯病理學(xué)變化；模型組肺組織出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)破壞；地塞米松組與金線蓮高劑量組少量炎癥細(xì)胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)基本完整；金線蓮中劑量組和金線蓮低劑量組有較多炎癥細(xì)胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)存在破壞，見圖1（插頁）。

圖1 小鼠肺組織病理學(xué)觀察

2.2 6 組小鼠肺組織W/D 比較 與模型組比較，對照組、地塞米松組、金線蓮高劑量組、金線蓮中劑量組肺組織W/D 顯著降低（P＜0.01），見表1。

表1 6 組小鼠肺組織的W/D 比較

2.3 6 組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞因子水平的比較 與模型組比較，對照組、地塞米松組、金線蓮高劑量組肺泡灌洗液中IL-6、MCP-1、IL-12/p70、IFN-γ、TNF-α 和IL-10 的水平均顯著降低（均P＜0.05）；金線蓮中劑量組IL-6、IFN-γ、TNF-α 和IL-10 水平均顯著降低（均P＜0.05），金線蓮低劑量組，各炎癥細(xì)胞因子水平變化均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 6 組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞因子水平比較

2.4 6 組小鼠肺組織中MPO、p-ERK、IκBα 和p-IκBα蛋白表達(dá)水平比較 與模型組相比，對照組、地塞米松組與金線蓮高劑量組肺組織MPO、p-ERK、p-IκBα蛋白表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05），但I(xiàn)κBα 蛋白表達(dá)水平均無顯著性變化（均P＞0.05）。見圖2（插頁）和表3。

圖2 免疫組化檢測小鼠肺組織MPO、IκBα、p-ERK、p-IκBα 的表達(dá)情況

表3 6 組小鼠肺組織中MPO、p-ERK、IκBα 和p-IκBα 蛋白表達(dá)水平比較

2.5 6 組小鼠肺組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AMPKα、p-AMPKα、MPO 蛋白相對表達(dá)量比較 與模型組相比，對照組、地塞米松組、金線蓮高劑量組、金線蓮中劑量組肺組織中p-ERK、p-JNK、pp38、p-AMPKα、MPO 蛋白相對表達(dá)量顯著降低（均P＜0.01），ERK、JNK、p38、AMPKα 蛋白相對表達(dá)量未見顯著變化，見圖3 和表4。

圖3 小鼠肺組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AMPKα、p-AMPKα、MPO 蛋白電泳圖

表4 肺組織中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AMPKα、p-AMPKα、MPO 蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

ALI 是一種以呼吸困難、急性低氧呼吸衰竭、雙側(cè)肺浸潤、肺水腫、進(jìn)行性低氧血癥等癥狀為特征的危重癥綜合征，當(dāng)氧合指數(shù)＜200時即被稱為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），ARDS 是由ALI 發(fā)展而來的一個復(fù)雜的級聯(lián)過程，是同一疾病過程的兩個階段[14]。該病發(fā)病率較高，是新型冠狀病毒感染重癥患者的常見并發(fā)癥。目前臨床上缺乏特異有效的治療手段，通常只能采用以控制感染、機(jī)械通氣、液體管理等為主的支持性治療。研究發(fā)現(xiàn)，以金線蓮為主藥的方劑治療新型冠狀病毒感染患者，可顯著改善患者咽痛、發(fā)熱、喘憋氣促等臨床癥狀，縮短呼吸道病原核酸檢測轉(zhuǎn)陰時間[15]。這提示金線蓮可能對LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠具有保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)在ALI 的發(fā)病過程起到關(guān)鍵作用。炎癥反應(yīng)促使過多的炎癥細(xì)胞遷移并釋放大量促炎和細(xì)胞毒介質(zhì)，造成血管通透性廣泛增加和上皮損傷，導(dǎo)致間質(zhì)及肺泡水腫和透明膜發(fā)育，過度的炎癥過程在ALI 的病理生理中起著關(guān)鍵的有害反應(yīng)，有效控制過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展是目前治療ALI 的重要策略[16-17]。金線蓮提取液通過抑制巨噬細(xì)胞釋放炎性因子和上調(diào)抗炎因子水平發(fā)揮對LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用[18]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS 模型小鼠肺組織病理切片伴有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔及肺泡壁增寬，肺組織的W/D 升高，說明模型建立成功。使用金線蓮提取物干預(yù)ALI 小鼠，小鼠肺組織病理損傷有所減輕，炎癥細(xì)胞浸潤改善。這提示金線蓮提取物對LPS 所致ALI 小鼠肺部病理變化有較好的改善作用。ELISA 檢測顯示高劑量金線蓮提取物可使肺泡灌洗液中IL-6、MCP-1、IL-12/p70、IFN-γ、TNF-α 和IL-10 水平不同程度降低（均P＜0.05），提示金線蓮提取物通過抑制炎癥過度反應(yīng)、降低中性粒細(xì)胞的浸潤來保護(hù)LPS 誘導(dǎo)的ALI。

MPO 是中性粒細(xì)胞外捕網(wǎng)的重要成分，亦是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，具有促氧化和促炎的特性，其異常表達(dá)可激活炎癥反應(yīng)信號進(jìn)而誘發(fā)各種慢性炎癥性疾病[19-20]。本研究的Western blot 檢驗和免疫組化實驗均驗證了金線蓮提取物可使經(jīng)LPS 誘導(dǎo)的ALI 小鼠肺組織中升高的MPO 表達(dá)水平顯著降低，提示金線蓮提取物具有顯著的抗炎作用。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶參與了全身炎癥反應(yīng)及其調(diào)控機(jī)制。目前研究表明，ALI 過程中MAPK 信號通路可調(diào)節(jié)下游產(chǎn)物活性，影響炎癥細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮、在炎癥部位激活并釋放炎癥因子[21]。其中，ERK、JNK 和p38 等蛋白質(zhì)已證實與ALI 關(guān)系密切[22]。當(dāng)MAPK 通路被激活時，p-ERK、p-p38 和p-JNK 單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，誘導(dǎo)相關(guān)炎癥因子靶基因的表達(dá)并促進(jìn)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，澤漆水提物可通過下調(diào)JNK、p38、ERK1/2 蛋白表達(dá)，降低炎癥因子TNF-α、IL-6 等細(xì)胞因子的分泌，從而減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI 的炎癥反應(yīng)，減輕肺部損傷；麻杏石甘湯通過抑制炎癥反應(yīng)以改善LPS 誘導(dǎo)的ALI，原因可能是麻杏石甘湯可顯著下調(diào)肺組織中NF-κB、ERK1/2、JNK 和p38 的蛋白表達(dá)從而影響MAPK/NF-κB 信號通路；p38 抑制劑可通過調(diào)節(jié)Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞失衡來減輕LPS 導(dǎo)致的ALI[23-25]。種種證據(jù)表明，MAPK 信號通路可作為研究治療ALI 的潛在病理機(jī)制。本研究顯示，相較模型組，金線蓮高、中劑量組肺組織中p-ERK、p-JNK、pp38、p-AMPKα 和MPO 蛋白相對表達(dá)量顯著降低，p-ERK、p-IκBα 和MPO 蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示金線蓮對ALI 小鼠的抗炎作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MAPK 信號通路有關(guān)。

綜上所述，金線蓮一定程度上改善了LPS 誘導(dǎo)的小鼠ALI，其潛在的機(jī)制可能是通過MAPK 信號通路干預(yù)細(xì)胞因子，發(fā)揮抗炎作用。但本實驗未能就金線蓮對MAPK 信號通路靶向調(diào)節(jié)作用及其上下游蛋白的反饋性調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究，擬在今后的實驗中對上述問題做進(jìn)一步討論。總之，調(diào)控MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”是金線蓮防治ALI 的有效靶點之一，提示金線蓮藥物及其新型制劑的開發(fā)可能是一種新的治療策略。