瓜蔞皮注射液及其中間體中17 種氨基酸含量測(cè)定及其變化規(guī)律研究

陶 香，張靜嫻，胡 青，孫 健，董 瑩，丁金國(guó)，于 泓，沈盈盈，毛秀紅，季 申*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203； 2.上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203； 3.上海第一生化藥業(yè)有限公司，上海 200240）

瓜蔞皮注射液是以瓜蔞皮為原料，利用現(xiàn)代工藝制成的中藥注射液，具有行氣除滿、開胸除痹功效，常用于冠心病、穩(wěn)定型心絞痛、心力衰竭的治療［1-6］，具有改善心肌缺血、抗血栓、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用［7-9］。近年來(lái)，瓜蔞皮注射液臨床應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，在治療心、腦、肺等臟器疾病中發(fā)揮著重要作用，以因動(dòng)脈阻塞引起的心肌缺血缺氧性疾病居多［10-12］。

瓜蔞皮含有豐富的氨基酸，文獻(xiàn)［13］ 測(cè)定了不同產(chǎn)地、品系該藥材中18 種游離氨基酸的含量，發(fā)現(xiàn)高達(dá)37.71 mg/g； 文獻(xiàn)［14］ 在雙邊栝樓果實(shí)各部位中檢測(cè)了19 種氨基酸，其中果皮中含量較高的有瓜氨酸、精氨酸、賴氨酸等； 文獻(xiàn)［15-18］ 報(bào)道了瓜蔞皮經(jīng)水提醇沉、732 型陽(yáng)離子交換樹脂后制成注射液，主要富集氨基酸、核苷、生物堿等兩性、堿性化合物，其中氨基酸含量最高。目前，瓜蔞皮注射液國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［19］采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總氨基酸含量，缺乏專屬性，結(jié)果不夠準(zhǔn)確。因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定瓜蔞皮注射液及其中間體中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸的含量，并考察其變化規(guī)律，以期為該制劑質(zhì)量控制關(guān)鍵因素研究提供參考。

1 材料

Agilent 1290 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）； Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）； 電子分析天平［0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； 精密PH 計(jì)（瑞士Mettler-Toledo公司）。鄰苯二甲醛（OPA） 購(gòu)自美國(guó)Pickering Laboratories 公司； 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC） 購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司； 巰基丙酸購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar 公司。氨基酸混合物（批號(hào)140624-201506，包括天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、賴氨酸） 及鳥氨酸（批號(hào)140847-201901）、瓜氨酸（批號(hào)110875-201607）、γ-氨基丁酸（批號(hào)100482-201601） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院，純度均≥98%。瓜蔞皮注射液共6 批，批號(hào)2205203 （編號(hào)SX1）、2206201 （編號(hào) SX2）、2206202 （編號(hào)SX3）、2205201 （編號(hào) SX4）、2205202 （編號(hào)SX5）、2206203 （編號(hào)SX6），經(jīng)水提醇沉、732 型陽(yáng)離子交換柱等10 道工序后得到中間體，分別為煎煮合并液（編號(hào)Ⅰ）、減壓濃縮液（編號(hào)Ⅱ）、一次酒沉液（編號(hào)Ⅲ）、一次酒沉濃縮液（編號(hào)Ⅳ）、二次酒沉液 （編號(hào)Ⅴ）、二次酒沉濃縮液（編號(hào)Ⅵ）、氨水洗脫液（編號(hào)Ⅶ）、洗脫濃縮液（編號(hào)Ⅷ）、調(diào)酸冷藏過(guò)濾液（編號(hào)Ⅸ）、瓜蔞皮注射液制劑（編號(hào)Ⅹ），均由上海第一生化藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。乙腈、甲醇為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司； 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼酸均為分析純，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)） 上海化學(xué)試劑公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）； 流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液（pH＝7.8，制備方法為取磷酸氫二鈉71.8 g，超純水溶解并稀釋至1 000 mL； 取磷酸二氫鈉2.76 g，去離子水溶解并稀釋至100 mL，分別取兩者915、85 mL 混合，搖勻，即得） （A） - ［甲醇-乙腈-水（45 ∶45 ∶10） ］ （B），梯度洗脫（0 ～6 min，1% ～10% B； 6 ～20 min，10% ～38% B； 20 ～28 min，38% ～40%B）； 體積流量1 mL/min； 柱溫45 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)0～20 min 338 nm，20 min 后（即賴氨酸出峰后） 262 nm； 進(jìn)樣量1 μL。

衍生化試劑包括0.4 mol/L 硼酸緩沖液（pH ＝10.2），制備方法為取硼酸適量，制成0.4 mol/L溶液，40%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至10.2，即得；1%OPA 溶液，制備方法為稱取OPA 80 mg，加硼酸緩沖液7 mL、乙腈1 mL、巰基丙酸125 μL，混勻，即得； 0.5% FMOC 溶液，制備方法為稱取FMOC 50 mg，適量乙腈-四氫呋喃（4 ∶6） 溶解，稀釋至10 mL，即得。柱前衍生化反應(yīng)中進(jìn)樣瓶1～4 分別為OPA、FMOC、水、硼酸鹽緩沖液，分別從瓶3 中吸取0 μL （水，清洗針頭）； 瓶4 中抽取7 μL （硼酸鹽緩沖液）； 吸取樣品1 μL； 瓶3 中吸取0 μL （水，清洗針頭）； “在空氣中” 以500 μL/min體積流量混合8 μL，共5 次； 瓶1 中吸取1 μL （OPA）； 瓶3 中吸取0 μL （水，清洗針頭）； “在空氣中” 以500 μL/min 體積流量混合9 μL，共25 次； 瓶2 中吸取1 μL （FMOC）； 瓶3中吸取0 μL （水，清洗針頭）； “在空氣中” 以500 μL/min 體積流量混合10 μL，共50 次； 進(jìn)樣。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品谷氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、鳥氨酸各12.5 mg，天冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸各5 mg，γ-氨基丁酸25 mg，置于同一50 mL 量瓶中，0.1 mol/L 鹽酸溶解并稀釋至刻度，制成貯備液，分別精密量取適量，0.1 mol/L 鹽酸稀釋，即得（谷氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、鳥氨酸質(zhì)量濃度均為10～250 μg/mL，天冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸質(zhì)量濃度均為4 ～100 μg/mL，γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為20～500 μg/mL）。

2.3 供試品溶液制備 分別精密移取瓜蔞皮注射液及其中間體（Ⅰ～Ⅹ） 3、1、3、1、3、1、1、1、1、1 mL 及同體積濃鹽酸，置于10 mL 安瓿瓶中，在150 ℃下水解1 h，放冷，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，10 mL 水分次洗滌，洗液并入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L 鹽酸溶解并分別轉(zhuǎn)移至10、25、10、25、10、25、10、25、25、10 mL 量瓶中，0.1 mol/L 鹽酸稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y） 對(duì)其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各氨基酸在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各氨基酸線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various amino acids

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸峰面積RSD 分別為2.79%、0.74%、1.09%、1.29%、0.46%、2.03%、3.59%、1.98%、1.25%、1.95%、0.73%、2.79%、4.01%、3.08%、0.69%、1.24%、2.89%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液（SX1），在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸含量RSD 分別為2.37%、2.48%、3.39%、3.31%、3.87%、5.29%、2.08%、1.77%、1.76%、2.38%、3.30%、2.05%、0.98%、2.80%、2.65%、3.08%、3.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.3” 項(xiàng)下同一供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸峰面積RSD 分別為5.46%、3.28%、2.93%、5.18%、3.86%、3.40%、3.81%、4.19%、2.60%、2.31%、1.89%、4.71%、1.75%、3.51%、1.70%、3.87%、1.89%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取本品（SX1）0.5 mL，平行6 份，按100%水平加入對(duì)照品溶液，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸平均加樣回收率分別為118.32%、119.48%、110.13%、117.68%、100.60%、103.85%、107.18%、111.76%、84.60%、83.42%、112.51%、111.88%、85.76%、105.20%、113.28%、97.27%、103.07%，RSD 分別為1.68%、1.29%、2.14%、2.77%、1.48%、1.75%、7.94%、1.05%、3.93%、1.38%、3.91%、6.90%、2.53%、2.17%、0.91%、1.67%、7.83%。

2.5 樣品含量測(cè)定 圖1 顯示，瓜氨酸含量從中間體Ⅵ至Ⅶ明顯升高。再測(cè)定10 道工序相應(yīng)中間體中17 種氨基酸含量，結(jié)果見表2，可知中間體Ⅰ中精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸含量較高，酪氨酸、瓜氨酸含量較低； 制劑中γ-氨基丁酸、丙氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、瓜氨酸含量較高，酪氨酸、纈氨酸含量較低。

圖1 瓜蔞皮注射液制備工藝流程及代表性色譜圖Fig.1 Preparation process flow and typical chromatograms of Gualoupi Injection

表2 各氨基酸含量測(cè)定結(jié)果（μg/mL）Tab.2 Results for content determination of various amino acids （μg/mL）

2.6 主成分分析和熱圖分析 以10 道工序相應(yīng)中間體的樣品編號(hào)為變量，氨基酸含量的歸一化值為觀察值，采用 UV Scaling 方式預(yù)處理后通過(guò)SIMCA-P 13.0 軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖2。由此可知，前2 個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為70.2%； 相同工序不同批次樣品較聚集，表明工藝穩(wěn)定性較好； 不同工序樣品聚為3 組，分別為Ⅰ～Ⅱ（Group 1）、Ⅲ～Ⅵ（Group 2）、Ⅶ～Ⅹ（Group 3），表明工序Ⅲ、Ⅶ對(duì)氨基酸組成的影響最大，而工序Ⅶ后氨基酸組成非常相似，Group 3 中不同工序中間體難以區(qū)分； Ⅰ～Ⅱ中精氨酸、賴氨酸含量較高，而Ⅶ～Ⅹ中瓜氨酸、酪氨酸含量較高。

圖2 主成分分析結(jié)果Fig.2 Results for principal component analysis

熱圖分析見圖3。由此可知，氨基酸含量聚為3 類，與主成分分析結(jié)果基本一致； 以工序Ⅶ為分界點(diǎn)，精氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸在制備過(guò)程中的含量由高轉(zhuǎn)低，而脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸含量恰好相反； 鳥氨酸含量由高轉(zhuǎn)低又升高，瓜氨酸在工序Ⅰ中的含量略高，Ⅱ～Ⅵ中非常低，Ⅶ中開始明顯升高； 酪氨酸含量從工序Ⅶ開始逐漸升高，最終趨于穩(wěn)定。

綜上所述，工序Ⅶ對(duì)氨基酸組成的影響最大。732 型陽(yáng)離子交換柱的填料為7%苯乙烯·二乙烯共聚體上帶有磺酸基（-SO3） 的陽(yáng)離子交換樹脂，在溶液中解離出H＋，樹脂解離后產(chǎn)生的SO3-能與溶液中帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合，主要用于富集堿性物質(zhì)或強(qiáng)酸性物質(zhì)。瓜蔞皮煎煮液水提醇沉后主要富集了多肽、氨基酸、核苷等親水性化合物，與離子交換劑的結(jié)合能力主要取決于其物理化學(xué)性質(zhì)和等電點(diǎn)，pH＜pI，氨基酸和多肽帶正電； pH＞pI，兩者帶負(fù)電［20］，并且環(huán)境pH 與等電點(diǎn)差值越大，與離子交換劑的結(jié)合能力越強(qiáng)； 被分離肽的電荷密度越大，與離子交換劑的結(jié)合能力也越強(qiáng)，以1 mol/L氨溶液（pH 約9.25） 洗脫陽(yáng)離子交換柱時(shí)，pI＞pH 的氨基酸和多肽帶正電，與樹脂交換基團(tuán)中的H＋發(fā)生交換而結(jié)合于柱上，如賴氨酸、精氨酸； pI＜pH 的兩者帶負(fù)電，無(wú)法與離子交換柱結(jié)合而被氨溶液洗脫下來(lái)，如脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸等，同時(shí)一些帶正電荷、密度較大的肽與樹脂交換基團(tuán)中的H＋發(fā)生交換，結(jié)合于柱上，而帶負(fù)電荷的肽被洗脫下來(lái)。另外，瓜氨酸通過(guò)陽(yáng)離子交換柱后含量明顯升高，結(jié)合文獻(xiàn)［21］ 報(bào)道，推測(cè)可能是由于氨水洗脫過(guò)程中精氨酸在有氧條件下氧化生成瓜氨酸和一氧化氮，最后被富集到制劑中，從而使該成分含量大大增加。

3 討論

3.1 氨基酸篩選 預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇20 種氨基酸進(jìn)行色譜條件考察，發(fā)現(xiàn)組氨酸、甲硫氨酸、色氨酸含量較低，衍生試劑在相應(yīng)色譜峰處有干擾，影響結(jié)果準(zhǔn)確性，故未測(cè)定三者； 在谷氨酸、甘氨酸色譜峰之間存在一個(gè)較大的未知峰，對(duì)比空白試劑色譜圖發(fā)現(xiàn)并非衍生試劑峰，并且經(jīng)谷氨酰胺、天冬酰胺、羥脯氨酸、組氨酸、甲硫氨酸等對(duì)照品比對(duì)后也均不符合，后期將繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。

3.2 衍生條件優(yōu)化 衍生化法檢測(cè)氨基酸是在一定pH 和3-巰基丙酸（3-MPA） 存在下，OPA 首先與一級(jí)氨基酸反應(yīng)，而二級(jí)氨基酸不與OPA 反應(yīng)，與3-MPA 結(jié)合后可降低氨基酸疏水性，再用FMOC 對(duì)二級(jí)氨基酸脯氨酸進(jìn)行衍生，故OPA 衍生化產(chǎn)物出峰時(shí)間比FMOC 衍生化產(chǎn)物更早，而過(guò)剩的FMOC 及其降解產(chǎn)物在二級(jí)氨基酸后出峰，不會(huì)干擾分析［22］。本實(shí)驗(yàn)考察了OPA、FMOC 在500 μL/min 速率下混合5、10、20、25、50、70、100 次時(shí)的衍生氨基酸峰面積，最終分別確定為25、50 次。

3.3 水解條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，一般在150 ℃下水解60 min 即可將結(jié)合氨基酸全部水解為游離型氨基酸，再對(duì)常用水解時(shí)間（30、60、90 min） 進(jìn)行考察，為了確保注射液中結(jié)合型氨基酸全部水解，最終確定為60 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用OPA-FMOC 在線衍生法測(cè)定瓜蔞皮注射液中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸的含量，具有良好的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，對(duì)提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供重要方法。然后，對(duì)10 道工序相應(yīng)中間體中上述氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，并開展主成分分析和熱圖分析，闡釋生產(chǎn)過(guò)程中其變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)醇沉和陽(yáng)離子交換樹脂對(duì)其組成的影響最大，可為指導(dǎo)優(yōu)化瓜蔞皮注射液生產(chǎn)工藝提供科學(xué)依據(jù)。