北豆根配方顆粒質(zhì)量評價(jià)

曹桂云，莊雪松，寧 波，林永強(qiáng)，王岱杰，崔偉亮，劉洪超，董曉弟，黃蒙蒙，孟兆青*

［1.山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司，山東省中醫(yī)藥治療呼吸系統(tǒng)疾病技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250103； 2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101； 3.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014］

北豆根為防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricumDC.的干燥根莖，功效清熱解毒、祛風(fēng)止痛，用于治療咽喉腫痛、熱毒瀉痢、風(fēng)濕痹痛［1］，主要活性物質(zhì)為木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿等生物堿類成分［2］，具有良好的抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、心血管保護(hù)活性［2-6］，其提取物已被開發(fā)成多種制劑，如北豆根片、北豆根膠囊等，并收載于2020 年版《中國藥典》。

中藥配方顆粒可直接沖服使用，符合現(xiàn)代人需求，已成為臨床用藥的重要形式。2021 年國家藥品監(jiān)督管理局頒布《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》［7］以規(guī)范配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)制定工作，保障其用藥質(zhì)量與安全。雖然北豆根配方顆粒在臨床上已得到廣泛應(yīng)用，但尚無按照上述要求進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的報(bào)道，不利于其質(zhì)量評價(jià)。因此，本實(shí)驗(yàn)基于標(biāo)準(zhǔn)湯劑建立北豆根配方顆粒特征圖譜及多成分含量測定方法，同時(shí)對兩者化學(xué)成分進(jìn)行一致性對比，以期為該制劑臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； XS105 型電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）； BSA224S-CW 型電子天平［萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；TS8606 型凍干機(jī)（德國菲維科公司）； KDM 型可調(diào)控溫電熱套 （山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）。木蘭花堿對照品（上海鴻永生物科技有限公司，批號130015-202105，純度≥98.0%）； 蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿對照品（江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，批號200056-190103、200470-210103，純度95.3%、94.4%）。北豆根共15 批，具體見表1，經(jīng)山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院林永強(qiáng)主任藥師鑒定為正品，根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》 制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切厚片，干燥，得到對應(yīng)批次飲片（批號與藥材相同），分別取至少100 g，浸泡30 min 后煎煮2 次，武火煮沸，文火煎煮時(shí)間分別為20、15 min，加水量分別為9、7 倍，煎煮液趁熱用200目篩過濾，60 ℃減壓濃縮，冷凍干燥72 h，得到凍干粉（編號S1 ～S15）。北豆根配方顆粒（山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司，每1 g 相當(dāng)于飲片5.0 g，批號 2010001、2010002、2010003，由20090011 批號飲片制備）。乙腈為色譜純（美國Fisher Scientific 公司）； 三乙胺為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 其他試劑均為分析純； 水為蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 特征圖譜建立

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.05% 三乙胺 （B），梯度洗脫（0～5 min，5%A； 5～15 min，5% ～15%A； 15 ～25 min，15% ～20% A； 25 ～45 min，20% ～60% A；45～50 min，60% A）； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長290 nm； 進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按蝙蝠葛堿計(jì)，應(yīng)不低于5 000。

2.1.2 供試品溶液制備 取配方顆?；驑?biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，研細(xì)（過5 號篩），取約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50% 甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取30 min，放冷，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對照藥材、對照品溶液制備 取北豆根對照藥材0.2 g，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備對照藥材溶液。取蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿對照品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分別含兩者20、35 μg 的對照品溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存）。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 取糊精（配方顆粒所用輔料） 適量，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 專屬性試驗(yàn) 取配方顆粒供試品、對照藥材、對照品、陰性樣品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 北豆根配方顆粒專屬性色譜圖Fig.1 Specific chromatogram of Beidougen Formula Granules

2.1.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以第6 個(gè)峰為參照，測得各標(biāo)識峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD 分別在0～1.50%、1.35% ～4.23%范圍內(nèi)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5.3 中間精密度試驗(yàn) 由不同分析人員在不同日期對同一批樣品按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，由2 臺儀器在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各標(biāo)識峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD 分別在0.05% ～1.64%、2.13% ～4.93%范圍內(nèi)，表明該方法中間精密度良好。

2.1.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下各精密吸取10 μL 進(jìn)樣測定，測得各標(biāo)識峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD 分別在0.05% ～2.12%、1.68% ～3.55%范圍內(nèi)，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5.5 耐用性試驗(yàn) 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下分別采用3 根Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，序 列 號 02243106323647、02243106323664、02183031012465） 測定同一份供試品溶液，測得各標(biāo)識峰相對保留時(shí)間RSD 均在1.23% ～2.48%范圍內(nèi)，并且不同儀器上均在0 ～3.46%范圍內(nèi)，不同體積流量下均在0 ～5.55% 范圍內(nèi)，不同柱溫下均在0 ～2.17%范圍內(nèi)，表明該方法耐用性良好。

2.1.6 圖譜生成 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)” 進(jìn)行分析，經(jīng)多點(diǎn)校正和Mark 峰匹配后生成標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照特征圖譜（圖2），共標(biāo)定了7 個(gè)特征峰，與對照品比對后確定了峰1 （木蘭花堿）、峰6 （蝙蝠葛蘇林堿）、峰7 （蝙蝠葛堿），并以6 號峰為參照（S），計(jì)算其余特征峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果見表2。

圖2 北豆根標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照特征圖譜Fig.2 Reference specific chromatogram of Beidougen Standard Decoctions

表2 共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積Tab.2 Relative retention time and relative peak areas of common peaks

2.1.7 相似度分析 3 批配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度均大于0.9，與相應(yīng)批次飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的相似度均大于0.95，表明兩者相似度較高；15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照特征圖譜的相似度均大于0.86，表明其制備工藝較穩(wěn)定。

2.1.8 聚類分析 以共有峰峰面積為變量，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。由此可知，當(dāng)刻度距離為15 時(shí)聚為2 類，S2、S3、S6、S9、S13、S14 為一類，其余批次為一類； 不同省份飲片所制備的標(biāo)準(zhǔn)湯劑無明顯區(qū)別，其中吉林、河北、山東產(chǎn)均可選用，但應(yīng)制定內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 15 批北豆根標(biāo)準(zhǔn)湯劑聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis dendrogram of fifteen batches of Beidougen Standard Decoctions

2.2 HPLC 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.05% 三乙胺 （B），梯度洗脫（0～5 min，5%A； 5～15 min，5% ～12%A； 15 ～25 min，12% ～45%A； 25～40 min，45% ～60%A）； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長290 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按蝙蝠葛堿計(jì)，應(yīng)不低于5 000。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取木蘭花堿對照品10.71 mg，置于10 mL 量瓶中，30%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.049 6 mg/mL的貯備液。分別精密稱取經(jīng)硅膠G 減壓干燥18 h 以上的蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿對照品10.83、11.13 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（兩者質(zhì)量濃度分別為1.032 1、1.050 7 mg/mL）（現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存）。

2.2.3 供試品溶液制備 同“2.1.2” 項(xiàng)。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取配方顆粒供試品、對照品、空白溶劑、陰性樣品溶液適量，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖4。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖4 各成分HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取木蘭花堿貯備液適量，置于10 mL 量瓶中，30%甲醇定容并稀釋至25.28、50.57、101.14、252.84、505.68 μg/L；精密量取蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿貯備液適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容并稀釋，其中前者質(zhì)量濃度分別為 25.81、51.61、103.21、206.42、412.84 μg/L，后者質(zhì)量濃度分別為26.27、52.53、105.07、210.13、420.27 μg/L，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，平行2 次。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批配方顆粒，共6 份，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿含量RSD 分別為0.82%、1.41%、0.48%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，常溫下于0、4、8、12、24、48 h在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿含量RSD 分別為0.37%、0.35%、2.12%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.5 中間精密度試驗(yàn) 由不同分析人員在不同日期分別按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，采用不同儀器在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿含量RSD 分別為1.43%、2.57%、1.16%，表明該方法中間精密度良好。

2.2.4.6 耐用性試驗(yàn) 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別采用3 根Waters XBridge C18色譜柱 ［4.6 mm×250 mm，5 μm，序列號 （SN）02243106323647、02243106323664、02183031012465］，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿含量RSD 分別為2.81%、2.34%、2.73%，表明該方法耐用性良好。

2.2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 取0.1 g 配方顆粒，分別加入木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿貯備液1.85、0.93、0.64 mL，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿平均加樣回收率分別為101.05%、100.32%、99.78%，RSD 分 別 為0.81%、1.29%、1.74%。

2.2.5 出膏率、成分含量、轉(zhuǎn)移率測定 先計(jì)算出膏率。再取15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑、3 批配方顆粒，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算成分含量。然后，取15 批北豆根飲片粉末（過3 號篩），每批約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入30% 甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取0.5 h，放冷，30%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表4～5。

表4 北豆根標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、成分含量、轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果Tab.4 Results for paste rate，constituent content and transfer rate determination of Beidougen Standard Decoctions

表5 北豆根配方顆粒出膏率、成分含量、轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果Tab.5 Results for paste rate，constituent content and transfer rate determination of Beidougen Formula Granules

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》 規(guī)定，配方顆粒研究需以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為橋梁，后者為衡量中藥配方顆粒與其相應(yīng)飲片臨床湯劑一致性的物質(zhì)基準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)在上述規(guī)定基礎(chǔ)上，收集15 批代表性北豆根藥材并炮制成飲片，以出膏率及木蘭花堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)對標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，再進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，用于制定相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 指標(biāo)成分選擇 蝙蝠葛堿、蝙蝠葛蘇林堿、木蘭花堿是北豆根主要成分，具有抗炎、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、降壓、抗氧化等活性，與藥材功效相關(guān)［8-17］，并且蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿也是2020年版《中國藥典》 北豆根藥材及飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)。因此，本實(shí)驗(yàn)以上述3 個(gè)化合物為指標(biāo)，保證了測定成分的代表性和測定方法的適用性。

3.3 指標(biāo)成分含量范圍、轉(zhuǎn)移率范圍制定 文獻(xiàn)［8］ 報(bào)道，以指標(biāo)成分含量平均值加減3 倍SD（或70% ～130% 平均值） 為含量、轉(zhuǎn)移率允許范圍。結(jié)果，北豆根標(biāo)準(zhǔn)湯劑中木蘭花堿含量平均值為31.48 mg/g，其加減3 倍SD、70% ～130%范圍分別為11.97 ～51.00、22.04 ～40.93 mg/g，但前者過寬，不利于產(chǎn)品質(zhì)量控制，故后者較合理； 北豆根配方顆粒中木蘭花堿含量范圍取標(biāo)準(zhǔn)湯劑按制成量折算后70% ～130% 平均值，即16.64 ～30.90 mg/g。另外，木蘭花堿從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的轉(zhuǎn)移率為45.42%，其平均值加減3 倍SD 范圍也過寬，故取70% ～130%。同法制定蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿含量、轉(zhuǎn)移率范圍。

4 結(jié)論

目前，配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑的一致性問題受到了廣泛關(guān)注，但僅有少數(shù)品種進(jìn)行了相關(guān)研究［18-19］，主要包括（1） 大多數(shù)研究開展時(shí)間較早，采用企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)配方顆粒進(jìn)行對比，所得結(jié)論無法為現(xiàn)行配方顆粒質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供參考；（2） 部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)性較差，導(dǎo)致結(jié)論可信度較低，故應(yīng)針對配方顆粒湯劑和傳統(tǒng)湯劑等效問題進(jìn)行深入考察。本實(shí)驗(yàn)以北豆根配方顆粒為研究對象，從出膏率、指標(biāo)成分含量和轉(zhuǎn)移率、特征圖譜一致性等方面出發(fā)，與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑所含成分進(jìn)行比較，既可為該制劑臨床應(yīng)用提供參考，也能為其他配方顆粒相關(guān)研究提供思路。