UPLC-Q Exactive 靜電場軌道阱高分辨質譜法同時測定金膽片中6 種成分的含量

金 舒

（無錫市藥品安全檢驗檢測中心，江蘇 無錫 214028）

金膽片是由龍膽、金錢草、虎杖、豬膽膏制成的復方制劑，具有消炎利膽、清熱解毒、排石等作用［1］。方中龍膽有瀉肝膽實火、清熱燥濕的功效［2］，其主要成分為龍膽苦苷，是龍膽藥材質量評價標準之一［3］。金錢草具有清熱解毒、利尿、消腫的功效［4］，2020 年版 《中國藥典》 對金錢草含量測定的質控指標為槲皮素和山柰酚。金錢草的水提物中，蘆丁是含量較高的黃酮苷類成分，且具有較強的生理與藥理活性［5］?；⒄染哂欣懲它S、清熱解毒之功效［6］，其主要成分虎杖苷為質量控制指標。虎杖中的白藜蘆醇具有抗氧化、保護心血管等多種功效，與虎杖臨床藥效密切相關，亦可作為質量控制指標［7］。

金膽片質量標準收載于《衛生部頒標準（中藥成方制劑） 》 《國家藥品監督管理局國家藥品標準》 中，僅有虎杖和豬去氧膽酸的TLC 鑒別，以及龍膽苦苷的含量測定。相關文獻僅對金膽片中1～3 種成分含量同時測定，涉及到的藥材最多2 種［8-13］，但未有研究對其中3 種及3 種以上中藥材主成分進行質量控制。中藥檢測的指標成分應與其生物活性具有相關性［14］。本研究擬建立UPLC-Q Exactive軌道肼高分辨質譜法同時測定金膽片中6 種成分的含量，以期為完善其質量標準提供參考。

1 材料

XS205 電子天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）； KH-300E 超聲儀（昆山禾創超聲儀器有限公司）； Millipore 純水系統（美國Millipore 公司）； Vanquish 超高效液相色譜儀、Q Exactive 靜電場軌道阱液相質譜聯用儀 （美國Thermo 公司）。

龍膽苦苷（批號110770-201918，純度97.1%）、虎杖苷（批號111575-201603，純度87.3%）、蘆丁 （批號100080-201409，純度91.9%）、白藜蘆醇 （批號111535-201703，純度99.4%）、槲皮素（批號100081-201616，純度99.1%）、山柰素（批號110861-201812，純度93.8%）對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。金膽片為自購市場銷售藥品（A 廠，批號190605； B 廠，批號20180402；C 廠，批號180502； D 廠，批號181101； E 廠，批號191001； F 廠，批號190528）。甲醇、甲酸為色譜純。

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜 HYPERSIL GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）； 流動相甲醇（A） -0.2% 甲酸（B），梯度洗脫（0～4.00 min，35%A； 4.01～8.00 min，65%A）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫35 ℃； 進樣量1 μL。

2.1.2 質譜 電噴霧離子源； 掃描模式t-SIM、PRM、Full MS/dd-ms2； 一級質譜分辨率（R） 70 000 FWHM； 負離子采集； 離子源溫度350 ℃； 毛細管電壓3.9 kV； 離子傳輸管溫度320 ℃； 鞘氣40 unit； 輔助氣15 unit； 掃描范圍m/z100～1 000； 選擇離子檢測（t-SIM） 駐留時間200 ms，其他參數見表1。

表1 各成分質譜參數

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品約10 mg，分別置于10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇超聲溶解，放冷，甲醇定容至刻度，作為貯備液，精密量取適量，甲醇稀釋成每1 mL分別含龍膽苦苷、虎杖苷、蘆丁各20 μg，槲皮素、山柰素各2 μg，白藜蘆醇約200 μg 的溶液，精密量取0.3 mL，置于20 mL 棕色量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取金膽片約3 g （5 片，相當于藥品的1 次服用量），精密稱定，研細，精密加入甲醇100 mL，超聲處理15 min，放冷，過濾，精密量取續濾液5 mL，置于100 mL 棕色量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例，分別制備缺龍膽、缺虎杖、缺金錢草的陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗 取對照品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項條件下進樣測定，結果見圖1 ～3，可知各成分互不干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 對照品溶液中各成分PRM 譜圖

圖3 各成分t-SIM 色譜圖

2.4 線性關系考察 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，采用倍數稀釋法依次稀釋，在“2.1” 項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，以信噪比（S/N） ＝3 為檢出限（LOD），信噪比（S/N） ＝10 為定量限（LOQ），結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.5 精密度試驗 取“2.2.1” 項下對照品溶液適量，在“2.1” 項條件下進樣測定6 次，測得龍膽苦苷、虎杖苷、蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素、山柰素峰面積RSD 分別為1.6%、0.5%、1.4%、1.0%、1.5%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取金膽片（E 廠，批號191001） 適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1” 項條件下進樣測定，測得龍膽苦苷、虎杖苷、蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素、山柰素含量RSD 分別為1.11%、1.40%、1.51%、0.54%、1.47%、0.97%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取“2.2.2” 項下供試品溶液（E 廠，批號191001） 適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項條件下進樣測定，測得龍膽苦苷、虎杖苷、蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素、山柰素峰面積RSD 分別為1.2%、1.1%、1.6%、1.0%、1.1%、1.0%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 稱取2.5 片各成分含量已知的金膽片（E 廠，批號191001） 粉末9 份，分為高、中、低質量濃度組，每組3 份，分別準確加入相當于各成分含量80%、100%、120%的對照品溶液，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項條件下進樣測定，計算回收率。結果，龍膽苦苷、虎杖苷、蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素、山柰素平均加樣回收率分別為 96.7%、96.8%、96.4%、97.3%、97.9%、97.1%，RSD 分別為 1.7%、1.6%、2.0%、1.9%、1.0%、0.6%。

2.9 樣品含量測定 取金膽片6 批，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，平行3 份，在“2.1” 項條件下進樣測定，結果見表3。另外，供試品溶液中出現與龍膽苦苷、虎杖苷、蘆丁、槲皮素、山柰素、白藜蘆醇對照品保留時間一致的色譜峰，對其進行PRM 分析，發現供試品中各色譜峰的二級碎片質譜圖均與相應的對照品一致。

表3 各成分含量測定結果（mg/片，n＝6）

3 討論

本研究考察了不同鍵合相色譜柱的分離效果，包括Agilent Poroshell EC-C18（4.6 mm × 100 mm，2.7 μm）、Agilent Extend-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），結果顯示，HYPERSIL GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）能使6 種成分均有適宜的保留，峰型均較好。然后，嘗試了不同比例甲酸銨-甲醇、甲酸-甲醇、乙酸銨-甲醇等多個流動相體系的梯度洗脫，結果顯示，流動相為甲醇-0.2%甲酸時各成分響應、峰形、分離度均較好。再對影響離子化效率的電噴霧離子化源溫度、毛細管電壓、離子傳輸管溫度、氣體流量、碰撞能量等條件進行了優化，確定了最佳質譜條件。在該條件下，龍膽苦苷和虎杖苷雖然在較近的保留時間處出峰，但其各通道之間無明顯干擾，均可達到完全分離。

含量分析發現，不同廠家金膽片中各成分含量存在一定的差異，這可能與所用中藥材質量及各廠家生產工藝有關。進一步對6 個廠家的供試品進行Full MS/dd-ms2分析，在7.03 min 處均出現m/z431.098 7 準分子離子，在30 eV的碰撞能量下，主要碎片離子為m/z269.045 8，見圖4。根據文獻［15］ 報道，推測該成分可能為大黃素-O-葡萄糖苷，來源于虎杖。

圖4 大黃素-O-葡萄糖苷在各模式下的色譜、質譜圖

4 結論

金膽片所含成分種類多，性質差異大，某些含量較低而無紫外吸收，還存在相互作用。由于Q Exactive 質譜儀具有高分辨率，目標選擇離子監測（t-SIM） 時通過各分析物的母離子可以進行定量分析。通過平行反應監測（PRM） 確認各分析物的碎片離子，可對化合物進行更為準確的定性［16-18］。本研究采用UHPLC-Q Exactive 靜電場軌道阱高分辨質譜技術，結合被測成分的理化性質采用梯度洗脫，同時測定金膽片中各指標成分的含量，發現該方法可在8 min 內快速測定，對保證該制劑質量、安全、有效具有重要意義。