基于類器官模型探究乳腺癌突變位點ER、PR、HER2與藥物敏感性的相關(guān)性

吳松齡 劉佳慧 詹巧惠 黃佳雯

廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院乳腺外科 (福建 廈門 361021)

乳腺癌(breast cancer)是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，在2019年新增約26萬例乳腺癌患者，約占新發(fā)腫瘤發(fā)生病例的30%，同時因乳腺癌死亡病例約4.1萬，約占該年癌癥相關(guān)死亡約占15%[1]。雖然關(guān)于乳腺癌的診斷和治療已經(jīng)取得了很大地進(jìn)展，但是乳腺癌患者的5年生存率仍然很低[2]。有研究預(yù)計乳腺癌發(fā)病率和死亡率將持續(xù)的大幅上升[3]，因此急需改善乳腺癌的治療策略。在臨床上，化療已經(jīng)成為大多數(shù)癌癥類型的金標(biāo)準(zhǔn)方法，包括乳腺癌。但是乳腺癌的亞型較為復(fù)雜，治療效果也大相徑庭。眾所周知，按免疫組織化學(xué)分類分為三種不同的亞型：雌激素/孕酮受體陽性(estrogen receptor+/progesterone receptor+ ER+/PR+)、人表皮生長因子受體2陽性(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)和三陰性乳腺癌(TNBC)[4]。大多的治療策略是根據(jù)乳腺癌的亞型，選擇靶向ER、PR或HER2的化療藥物，但是單獨使用靶向藥物治療極易誘導(dǎo)癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，例如，在治療早期，曲妥珠單抗治療HER2陽性的患者有著不錯的效果，而到晚期時，則會因為耐藥導(dǎo)致治療效果不理想[5]。因此，臨床上往往需要配合其他非ER、PR或HER2位點的靶向藥物進(jìn)行協(xié)同治療[6]。然而，同一藥物對不同亞型的乳腺癌有著不同的效果。有報道顯示，相對于ER-或PR-的腫瘤，長春花堿對ER+或PR+腫瘤的抑制效果顯著降低[7]，而氟維司群對ER+或PR+的腫瘤抑制效果顯著優(yōu)于陰性腫瘤[8]。可見，受體的表達(dá)水平可能與藥物的敏感性存在相關(guān)性。

另一方面，尋找合適的乳腺癌體外模型是藥敏相關(guān)研究的關(guān)鍵任務(wù)。乳腺癌具備高度的異質(zhì)性，離體的腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系缺少腫瘤生長微環(huán)境，容易導(dǎo)致遺傳特異性的缺失，模擬效果有限，無法作為乳腺癌患者藥敏實驗的體外模型[9]。目前，類器官被認(rèn)為是一種模擬患者腫瘤特征的體外模型，其可繼承原始腫瘤組織的基因組信息、轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)和組織學(xué)特征，是新藥開放和藥敏特征良好的體外模型[10]，因此，本研究以培養(yǎng)臨床腫瘤組織類器官為研究對象。探索ER、PR或HER2表達(dá)水平的高低對常見的20中FDA藥物敏感性的影響，為臨床選擇治療藥物提供有效的數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本收集本研究的開展經(jīng)過廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(NO.2020038)，在2020年08月至2021年08月期間收集了6份乳腺癌(BC)組織。本研究中所有患者都簽署了知情同意書，并且在收集患者之前沒有接受過放療或化療。

1.2 患者腫瘤源性類器官的培養(yǎng)將收集的腫瘤組織在無菌條件下切成1mm3的小塊，加入膠原酶A， 37℃震蕩孵育30分鐘，用移液槍溫和且反復(fù)吹打均勻，確保產(chǎn)生單細(xì)胞。隨后在4℃條件下，500 g離心10分鐘，用PBS洗滌2-3次后，將細(xì)胞沉淀重懸在含有2%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，并接種在含150 μL/cm2的Matrigel基質(zhì)膠的24孔板中。將類器官置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，待基質(zhì)膠凝固后加入含有ROCK和糖原合酶激酶(GSK)抑制劑，以及100 U/mL青霉素/鏈霉素的乳腺類器官培養(yǎng)基(中科普瑞昇，PRS-BCM-3D)。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，每2天更換新鮮培養(yǎng)基，生長14天。

1.3 實時熒光定量(Real-timeQuantitative PCR，RTqPCR) 通過TRIzol試劑提取腫瘤組織的RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Accurate Biology，AG11706)將1 μg RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR GREEN試劑盒(QIAGEN，218076)的操作步驟建立反應(yīng)體系，以GAPDH作為內(nèi)參對照，實驗設(shè)置6個重復(fù)。使用LightCycler 480(羅氏)儀器檢測腫瘤組織和類器官中ER、PR和HER2的表達(dá)水平，反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，40 s；38個循環(huán)；72℃，5 min。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列如表1。

表1 定量引物

表2 乳腺癌類器官對治療藥物的敏感性評分

1.4 Westernblot 收集腫瘤類器官，加入RIPA裂解液中，在冰上充分裂解，4℃，12000 r/min的離心10分鐘，收集上清。用SDS上樣緩沖液對50 μg蛋白充分變性，通過12%的SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，在室溫下用含有5% 牛奶的TBST緩沖液中封閉1小時，在4°C條件下，用一抗，anti-ER(abcam, ab92516)、anti-PR(abcam, ab16661)、anti-HER2(abcam, ab134182)過夜孵育PVDF膜。用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在 37°C 孵育 1 小時。用Image Lab software (Bio-Rad)顯影。使用 ImageJ 軟件對條帶強(qiáng)度進(jìn)行光密度定量，以β-actin為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化目的蛋白條帶強(qiáng)度。

1.5 類器官的藥敏測試將腫瘤類器官在體外培養(yǎng)4-5天后，選擇20種FDA批準(zhǔn)的藥物，包括：順鉑、卡鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、長春瑞濱、艾日布林、拓?fù)涮婵怠N-38、依托泊苷、阿霉素、吉西他濱、它莫西芬、曲貝丁、奧拉帕尼、伏立諾他、貝利諾斯塔特、西地拉尼布、帕唑帕尼、舒尼替、依維莫司。將20種藥物配制成不同濃度，濃度范圍為10 μmol/L至128 mmol/L或100 μmol//L至1.28 mmol/L等。孵育6天后，使用CellTiter-Glo 3D(Promega，G9682)測定細(xì)胞活力，使用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計算抑制率，抑制率(%)=(1-加藥孔吸光度/對照組吸光度)× 100%，并計算IC50。以各組類器官對藥物GR50所在濃度區(qū)間作為評分指標(biāo)，GR50最低值為10%(即是濃度最小的兩個點及更低的濃度所在范圍)記為10分，其余的濃度范圍，分別記為相應(yīng)的分?jǐn)?shù)(如下圖所示)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法所得實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，使用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，采用非配對t檢驗進(jìn)行差異性分析，以P＜0.05為是否具有統(tǒng)計學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌源性類器官的表征在顯微鏡下觀察到，第7天時，腫瘤細(xì)胞聚集形成的細(xì)胞團(tuán)；在第14天時，由約200-400 μm的圓柱形或立方體的腫瘤細(xì)胞緊密凝聚構(gòu)成的球形或卵形的細(xì)胞團(tuán)(圖1-A)。同時，為了測試乳腺癌類器官與乳腺癌組織的相似性，通過RT-qPCR觀察ER、PR和HER2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，相對于癌旁組織(Con)，ER在1號，5號和6號患者中表達(dá)量顯著增加，而在2、3、4號患者中顯著降低；PR在1號、2號、5號和6號患者中表達(dá)量顯著增加，而在3、4號患者中顯著降低；HER在3號和4號患者顯著增加，而在1、2、5、6號患者中顯著降低。同時在乳腺癌類器官中，ER、PR和HER2的表達(dá)水平與來源的腫瘤組織無顯著差異(圖1B、圖1C)。

圖1 乳腺癌源性類器官的表征。注：圖1A：光學(xué)顯微鏡下觀察乳腺癌類器官的形態(tài)(標(biāo)尺=200 μm)；圖1B～圖1C：RTqPCR觀察乳腺癌組織和乳腺癌類器官的組織學(xué)形態(tài)和ER和PR、HER2的表達(dá)水平。圖2 乳腺癌組織和類器官中ER、PR和HER2的表達(dá)水平。注：**P＜0.01。圖3 不同組別乳腺癌類器官在同濃度的20這種抗癌藥物中的細(xì)胞活力。

2.2 乳腺癌組織和類器官中ER、PR和HER2的表達(dá)水平隨后，為了觀察ER、PR和HER2的表達(dá)水平對化療藥物抗性的影響，通過western blot觀察各組類器官中ER和PR、HER2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在ER的表達(dá)水平中，相對于2號，3號和4號患者，1號5號和6號患者的ER表達(dá)水平顯著增加；在PR的表達(dá)水平中，相對于3號和4號，其余患者的PR表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)；在HER的表達(dá)水平中，相對于2號和3號，其余患者的HER表達(dá)水平顯著降低(圖2，P＜0.05)。因此我們將1號5號和6號患者列為ER高表達(dá)患者(ER-H，4例)，而2號，3號和4號患者被列為低表達(dá)(ER-L，2例)。另外，1號2號，5號和6號患者被列為PR高表達(dá)患者(PR-H，4例)，3和4號患者被列為低表達(dá)患者組；同時，1號2號，5號和6號被列為HER2高表達(dá)患者(HER-H，4例)，低表達(dá)組則是3號和4號(HER-L)。

2.3 ER、PR和HER2的表達(dá)水平對乳腺癌類器官藥敏的影響進(jìn)一步，觀察乳腺癌類器官的不同ER、PR和HER2的表達(dá)量對這些藥物的敏感性。結(jié)果顯示：相對于ER低表達(dá)組，在ER高表達(dá)的乳腺癌類器官對順鉑、卡鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、長春瑞濱、艾日布林、拓?fù)涮婵怠N-38和伏立諾他和帕唑帕尼呈現(xiàn)IC50顯著增加，評分降低；而對依托泊苷、阿霉素、吉西他濱、它莫西芬、曲貝丁、奧拉帕尼、貝利諾斯塔特、舒尼替和依維莫司呈現(xiàn)IC50顯著降低，評分增加；而乳腺癌類器官對西地拉尼布的IC50和評分與ER的表達(dá)量無關(guān)。相對于PR低表達(dá)組，在PR高表達(dá)的乳腺癌類器官對順鉑、卡鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、長春瑞濱、艾日布林、拓?fù)涮婵怠N-38和伏立諾他呈現(xiàn)IC50顯著增加，評分降低；而對依托泊苷、阿霉素、吉西他濱、它莫西芬、曲貝丁、奧拉帕尼、貝利諾斯塔特、帕唑帕尼、舒尼替和依維莫司呈現(xiàn)IC50顯著降低，評分增加；而乳腺癌類器官對西地拉尼布的敏感性對PR的表達(dá)量無關(guān)。相對于HER低表達(dá)組，在HER高表達(dá)的乳腺癌類器官對順鉑、卡鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、長春瑞濱、拓?fù)涮婵怠N-38、曲貝丁、帕唑帕尼、奧拉帕尼和舒尼替呈現(xiàn)IC50顯著降低，評分增加；而對依托泊苷、吉西他濱、它莫西芬和依維莫司呈現(xiàn)IC50顯著增加，評分降低；而乳腺癌類器官對伏立諾他、貝利諾斯塔特、艾日布林和西地拉尼布的敏感性對HER的表達(dá)量無關(guān)。可見，乳腺癌類器官ER、PR和HER2的表達(dá)水平不同，會導(dǎo)致細(xì)胞對藥物的敏感性不同。

3 討 論

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的癌癥，并且發(fā)病率和死亡率依然不斷上升，嚴(yán)重危害女性的身心健康[11]。在治療過程中，有許多因素決定乳腺癌患者的治療結(jié)局，其中化療藥物合理選擇顯得格外重要[12]。乳腺癌的化療方案取決于ER、PR和HER受體表達(dá)的情況。然而，臨床的數(shù)據(jù)表明，對于乳腺癌的化療效果參差不齊，主要由于不適合的治療以及多重耐藥性的產(chǎn)生[13]。因此，需要進(jìn)一步細(xì)化ER、PR和HER表達(dá)情況，制定治療方案。本研究在體外利用人來源乳腺癌類器官進(jìn)行藥敏實驗，分析ER、PR和HER表達(dá)水平與藥物敏感性的相關(guān)性。

目前，類器官被用于腫瘤體外模型，因其保留了腫瘤組織完整的信息。本研究構(gòu)建了乳腺癌患者來源的類器官，發(fā)現(xiàn)乳腺癌類器官的具備患者的腫瘤完整信息，具有大細(xì)胞核，高核質(zhì)比的腫瘤細(xì)胞特征，并且保持相同的ER、PR和HER的表達(dá)情況。可見，我們構(gòu)建的乳腺癌類器官在表征組織形態(tài)、細(xì)胞組成、標(biāo)志物表達(dá)與腫瘤組織相一致，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。

進(jìn)一步，我們細(xì)化了患者腫瘤組織和衍生的類器官中ER、PR和HER的表達(dá)水平，根據(jù)表達(dá)水平的高低，分為ER或PR或HER的高或低表達(dá)組，并進(jìn)行藥敏實驗。根據(jù)藥敏測試結(jié)果可知，高ER表達(dá)和高PR表達(dá)的類器官有著相近的藥敏結(jié)果。這可能由于在乳腺癌中，ER和PR的表達(dá)水平往往是一致的[14]。此外，不同受體表達(dá)量的乳腺癌類器官對藥物的敏感性呈現(xiàn)不同的敏感性。其中，在高表達(dá)ER/PR的類器官中，對順鉑顯示出耐藥，并且ER/PR的表達(dá)水平與乳腺癌類器官對順鉑的敏感性成負(fù)相關(guān)。有研究指出，順鉑可以劑量依賴的方式增加ER-α36的水平上調(diào)，而ER-α36可通過EGFR/ERK信號通路介導(dǎo)順鉑耐藥性的產(chǎn)生[15]。此外，高表達(dá)HER的類器官對順鉑也具有耐藥性，HER的表達(dá)水平與乳腺癌類器官對順鉑的敏感性成負(fù)相關(guān)。這可能由于HER可直接激活ERK通路產(chǎn)生耐藥。同時，研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)水平的HER乳腺癌患者對蒽環(huán)類藥物、紫杉烷類的敏感性低于表達(dá)水平低的患者，而加入曲妥珠單抗(一種抗HER的單克隆抗體)可以顯著恢復(fù)癌細(xì)胞對蒽環(huán)類藥物、紫杉烷類的敏感性[16]，相似的，本研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)水平的HER類器官對阿霉素、紫杉醇和多烯紫杉醇的敏感性顯著降低。同時，ER/PR高表達(dá)的類器官對紫杉烷類的敏感性也低于低表達(dá)的類器官。在Ying[17]等的報告中顯示ER陽性的乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)對紫杉醇的IC50為1183.06 nM，而ER陰性的乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)對紫杉醇的IC50為136 nM。此外，有研究顯示異巴查爾酮(Isobavachalcone)通過ER-α降低CD44的表達(dá)恢復(fù)ER+乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性[18]。可見，順鉑和紫杉醇不適合被選為治療ER、PR或HER表達(dá)水平較高的乳腺癌患者，可能在三陰性乳腺癌患者的治療中會有比較好的效果。

ER、PR或HER高表達(dá)的乳腺癌類器官對奧拉帕尼和舒尼替、曲貝丁均較敏感。其中，HER表達(dá)量與舒尼替的敏感性成正相關(guān)，而ER/PR的表達(dá)量卻與舒尼替的敏感性無相關(guān)性。研究表明，HER是癌細(xì)胞的驅(qū)動信號，可啟動癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，而舒尼替是一種小分子的吲哚酮化合物[19]，可抑制多種酪氨酸受體激酶，不包括阻斷表皮生長因子受體和HER的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，從而抑制信號的傳遞，抑制癌細(xì)胞的活性[20]。Kim[21]等研究發(fā)現(xiàn)舒尼替能降低ER+乳腺癌組織中血小板衍生生長因子(PDGF)和金屬蛋白酶-1的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞發(fā)育，其中PDGF和金屬蛋白酶-1均是與癌細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因。相似的，本研究發(fā)現(xiàn)舒尼替對于ER-乳腺癌類器官的抑制效果也十分顯著。另一方面，奧拉帕尼是一種聚-ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的類似物，通過與NAD+競爭性結(jié)合PARP的催化域活性位點，抑制PARP酶活性，從而阻礙癌細(xì)胞DNA單鏈斷裂時的堿基修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。在所有乳腺癌亞型中，均存在抑癌基因BRCA1/2的突變情況，而發(fā)生BRCA1/2突變將會增加罹患乳腺癌的風(fēng)險，而在臨床上奧拉帕尼已經(jīng)顯示出對激素受體陽性或陰性患者治療的有效性[22]。本研究也發(fā)現(xiàn)不同表達(dá)水平的ER、PR或HER類器官均對奧拉帕尼顯著敏感。此外，所有類器官對曲貝丁的IC50均比較低，這可能由于曲貝丁是一種天然分離的烷化劑，相對于其它抗腫瘤藥物有著獨特的作用機(jī)理，其可通過結(jié)合 DNA 來阻止細(xì)胞分裂[23]。因此，我們認(rèn)為奧拉帕尼和舒尼替、曲貝丁具有作為化療的主要藥物或輔助內(nèi)分泌治療有候選藥物的潛力。同時，本研究對其它幾種常見的治療乳腺癌的藥物也進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示受體的表達(dá)量會影響類器官對大多數(shù)藥物的敏感性，包括吉西他濱、它莫西芬。可見ER、PR和HER的表達(dá)量可為藥物的選擇提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

綜上所述，ER、PR或HER的表達(dá)量與乳腺癌對大多數(shù)藥物敏感性有顯著的影響，包括順鉑、紫杉醇等。因此，在制定治療方案是需要考慮這些受體的表達(dá)量。不過，本研究的樣本量較少，需要的擴(kuò)大樣本數(shù)進(jìn)一步論證。