低共熔溶劑雙水相萃取-UPLC法檢測吸煙者尿液中雜環胺類化合物

李 敏，賀姍姍，王宏宇，莊家瑩，金永日，李緒文

（1. 鄭州輕工業大學食品與生物工程學院, 鄭州 450001;2. 吉林大學化學學院, 長春 130012）

雜環胺（HAAs）是蛋白質或氨基酸在加熱過程中產生的熱解產物，具有潛在的致癌致突變性，目前已經發現并鑒定出超過30 種HAAs，可在經熱處理的富含蛋白質的食物［1，2］、 咖啡［3］、 環境水［4］及香煙煙氣［5，6］中檢測到. 香煙煙氣是使人類暴露于HAAs 的一種重要途徑，受到了廣泛關注. 1962 年，Poindexter 和Carpenter［7］首次在香煙煙氣中檢出2 種HAAs：β-咔啉和咔啉. 1997 年，Hoffmann［8］發現Harman，Norharman，AαC和MeAαC等8種雜環胺為香煙主流煙氣中的主要有害物質. AαC是香煙煙霧中含量最多的HAAs，其含量為25～260 ng/支［9］. 香煙煙氣中HAAs含量雖低，但具有顯著的生物毒性，長期暴露于這些HAAs 中會對人體構成潛在的健康威脅. 因此，有必要開發一種靈敏、 快速的評估和監測HAAs暴露水平的方法.

評估和監測HAAs 的暴露水平主要是通過檢測尿液、 血漿、 膽汁、 毛發和乳汁等生物樣品中的HAAs及其代謝產物的含量. 相比之下，尿液樣品采集方便、 無侵害性，常作為HAAs暴露水平監測的有效生物樣品［5］. 雜環胺的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法和液相色譜-質譜聯用（LC-MS）法.由于尿液中的基質干擾和HAAs含量極低（通常為ng/g），為準確測定其含量，在進行HPLC或LC-MS分析之前，需要進行適當的樣品預處理. 目前，尿液中雜環胺分析常用的樣品前處理方法為液-液萃取（LLE）串聯固相萃取（SPE）法. Fu 等［5］建立了一種LLE-SPE 法結合UHPLC-MS/MS 測定吸煙者尿液中HAAs 的方法，首先使用乙酸乙酯提取HAAs，然后使用ProElutPXC（150 mg）固相萃取柱純化. 但LLE-SPE 方法繁瑣、 耗時且需使用較多的有機溶劑. 基于此，Zhang 等［10］建立了一種磁性固相萃取（MSPE）方法用于分析吸煙者尿液中的HAAs，但該方法仍需使用有機溶劑（乙腈）洗脫目標HAAs且磁性吸附劑的制備過程繁瑣且耗時. 因此，開發簡單、 快速且環保的樣品前處理方法對于尿液中HAAs的檢測分析具有重要意義.

雙水相體系（ATPS）具有環保、 分離時間短及操作簡便等特點，被廣泛應用于蛋白質、 DNA、 金屬離子和抗生素等多種目標化合物的提取與分離［11，12］. 按照其兩相物質組成的不同，ATPS體系可分為高聚物-高聚物體系、 表面活性劑-表面活性劑體系、 高聚物-鹽體系和離子液體-鹽體系（IL-ATPS）［13，14］等. 與其它ATPS 相比，IL-ATPS 體系具有相分離快、 黏度低、 萃取效率高和無乳化現象等特點，引起了研究者的重點關注［15，16］. 然而，大多數ILs制備困難、 成本高，其潛在生物毒性（如吡啶或咪唑基IL）對環境也有一定影響［17，18］，從而限制了IL-ATPS的進一步發展.

低共熔溶劑（DES）作為一種新興的綠色溶劑，克服了ILs的缺點，它是由氫鍵供體（HBD）和氫鍵受體（通常為季銨鹽，HBA）組合而成的二元或三元共晶混合物，其熔點低于單獨任一組分的熔點［19，20］.DES被稱為類離子液體混合物，具有與ILs相媲美的理化性質，還有制備簡單、 生物降解性好及成本低等特性，可作為ILs的潛在替代品［21，22］. 2014年，Zeng等［23］首次提出DES-ATPS體系，用于從水溶液中提取牛血清白蛋白. 此后，DES-ATPS在蛋白質、 DNA、 RNA和其它目標化合物［24～26］的萃取研究中展現出較大的應用潛力，成為近幾年研究的熱點.

本文制備了7種以氯化膽堿（ChCl）為氫鍵受體的DES，與無機鹽構建成雙水相體系，并結合UPLC檢測技術，用于分析吸煙者尿液中5種HAAs（IQ，IQ［4，5-b］，Harman，Norharman和Phe-P-1），以期為香煙煙氣中HAAs暴露風險評估提供新的研究思路.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

2-氨基-3-甲基-咪唑并［4，5-f］-喹啉（IQ，純度＞98%）、 2-氨基-1-甲基-咪唑并［4，5-b］-喹啉（IQ［4，5-b］，純度＞98%）、 1-甲基- 9H-吡啶并［3，4-b］吲哚（Harman，純度＞98%）、 9H-吡啶并［3，4-b］吲哚（Norharman，純度＞98%）和2-氨基-5-苯基吡啶（Phe-P-1，純度＞95%），加拿大Toronto Research Chemicals公司； 甲醇和乙腈，色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司； 乙酸和乙酸銨，色譜純，天津大茂化學試劑廠； 氯化膽堿、 K2HPO4、 K3PO4、 1，4-丁二醇（1，4-Butanediol）、 乙二醇（Ethylene glycol）、甘油（Glycerol）、 木糖醇（Xylitol）、D-山梨醇（D-Sorbitol）、D-（+）-葡萄糖［D-（+）-Glucose］和meso-赤鮮醇（meso-Erythritol），分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司.

吸煙者尿液樣本由中國煙草總公司鄭州煙草研究院提供，包括20名吸煙者（來自煙齡1～3年的健康成年男性）和20名非吸煙者. 在采集樣本前，志愿者禁止攝入肉食和烘烤類食物2天，實驗期間吸煙者沒有吸煙限制. 然后，收集志愿者24 h的尿液樣品，儲存于-80 ℃冰箱中備用.

Agilent 1290 Infinity II 型超高效液相色譜儀（UPLC），美國Agilent 公司； Bruker Avance Ⅲ 600 M 型超導核磁共振波譜儀（1H NMR，600 MHz，TMS為內標，DMSO-d6為溶劑），德國Bruker 公司； Vertex 70型傅里葉變換紅外光譜儀（溴化鉀壓片），德國Bruker公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 UPLC色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX XDB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相由乙腈（A）和水（B，含1 mmol/L 乙酸銨和0.05%乙酸）組成，梯度洗脫條件如下： 0～5.0 min，15%A； 5.0～5.1 min，15%～20%A；5.1～11.0 min，20%A； 11.0～11.1 min，20%～30%A； 11.1～23.0 min，30%A； 柱溫為30 ℃； 流速為1.0 mL/min； 檢測波長為248 nm； 進樣量為10 μL. 所得UPLC 色譜圖如圖1所示.

Fig.1 UPLC chromatograms of the mixed standardsolution(a), the spiked urine sample extracted with DES-APTS(b), the spiked urine sample extracted without DES-APTS(c) and the blank urine sample(d)Peak 1: IQ; peak 2: IQ[4,5-b]; peak 3: Harman; peak 4:Norharman; peak 5: Phe-P-1.

1.2.2 DES 的制備 以氯化膽堿（ChCl）為HBA，分別與1，4-丁二醇、 乙二醇、 甘油、木糖醇、D-山梨醇、D-（+）-葡萄糖和meso-赤鮮醇按摩爾比1∶1 混合于100 mL 燒杯中，于130 ℃加熱攪拌，直至形成無色透明的溶液. 冷卻至室溫后，置于干燥器（硅膠）中保存，備用. 7種DES的組成見表1.

Table 1 Compositions of the synthesized DES using ChCl as HBA

1.2.3 雙水相體系相圖的繪制 使用濁點滴定法繪制相圖［27］. 準確稱量一定質量的DES于10 mL離心管中，將已知濃度的無機鹽溶液逐滴加入到該離心管中直到混合溶液變渾濁，記錄此時加入的無機鹽溶液的質量； 隨后滴加蒸餾水使之變澄清，記錄此時加入水的質量； 然后再逐滴加入已知濃度的無機鹽溶液，使之再次變混濁，再次記錄此時加入的無機鹽溶液的質量； 反復進行上述操作，直至獲取足夠多的數據來繪制相圖，x和y軸分別代表無機鹽和DES的質量分數.

1.2.4 雙水相萃取 將尿液樣本在室溫下自然解凍，取1 mL 尿液樣本與90 μL 12 mol/L HCl 混合，于70 ℃下加熱3 h. 冷卻至室溫后，用10 mol/L NaOH溶液將尿液的pH值調至中性； 然后向尿液中加入混合標準溶液并渦旋振蕩30 s 使其混合均勻； 隨后加入200 mg ChCl/Buta 和0.8 g K2HPO4，渦旋振蕩3 min，在8000 r/min轉速下離心3 min. 從離心機取出后尿液樣本上下界面清晰，用微量注射器移取上層富DES相并記錄其體積，經0.22 μm濾膜過濾，待UPLC檢測.

2 結果與討論

2.1 DES結構表征

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）可以用于檢測化合物的化學鍵和官能團，從而掌握其結構信息. ChCl和7 種DES 的FTIR 譜圖如圖2 所示. 650.4 和1050.2 cm-1處的吸收峰可分別歸屬為O—H 鍵的彎曲振動和醇或糖的C—O 鍵（C—O—H）的伸縮振動. 7 種DES 在3400 cm-1附近均有顯著寬峰，表明存在大量的氫鍵. 與ChCl（3421.1 cm-1）相比，ChCl/EG，ChCl/G，ChCl/Sor，ChCl/Buta，ChCl/Glu，ChCl/Xyl 和ChCl/Ery 中O—H 鍵的伸縮振動峰向低波數方向發生了移動［28］（3398.0，3394.1，3390.2，3388.3，3380.6，3394.1 和3384.5 cm-1），進一步證實了氫鍵的存在.

Fig.2 FTIR spectra of ChCl and seven DES

為了進一步驗證DES 的結構，測定了以DMSO-d6為溶劑的7種DES 的1H NMR 譜圖. 圖3中δ3.17（s，9H），3.46（t，2H）和3.82（t，2H）處均為ChCl的質子信號，其余各信號均歸屬于相應氫鍵供體的質子信號，并未出現其它新化學鍵的質子信號，說明制備過程中未發生化學反應［29］，進一步說明氯化膽堿與氫鍵供體之間的作用力為氫鍵.

Fig.3 1H NMR spectra of ChCl and seven DES

2.2 DES-ATPS相圖及成相規律

雙水相相圖的每一條雙結線均由眾多成相臨界點構成. 位于雙結線之上的區域代表該濃度下的鹽和低共熔溶劑具有成相能力，為雙水相體系； 雙結線之下的區域則是均一液體，無成相能力，為單相體系. 成相能力越強，雙結線越接近坐標原點［30］. 由圖4可知，當無機鹽為K2HPO4時，其與7種DES的成相能力依次為ChCl/Buta＞ChCl/EG＞ChCl/G＞ChCl/Glu＞ChCl/Sor≈ChCl/Ery＞ChCl/Xyl. 由此可見，DES 種類不同，形成雙水相的能力不同，分析其原因可能與DES的親水性、 黏度和密度等多種因素有關［24，31］.其中，親水性是影響相形成能力的主要因素之一，通常情況下氫鍵供體中羥基含量越少，親水性越弱，越有利于成相. 7種氫鍵供體［1，4-丁二醇、 乙二醇、 甘油、meso-赤鮮醇、 木糖醇、D-（+）-葡萄糖和D-山梨醇］含有的羥基數目分別為2，2，3，4，5，5和6，ChCl/Buta，ChCl/EG，ChCl/G，ChCl/Glu，ChCl/Sor與K2HPO4的成相能力符合上述規律，而ChCl/Ery 和ChCl/Xyl 則不符合，推測ChCl/Ery 和ChCl/Xyl 的成相能力還與DES 的黏度和密度有關，進一步證明了導致成相能力差異的原因是多種因素共同作用的結果.

Fig.4 Phase diagrams of DES-based ATPSWsalt, Wwater and WDES represent the weight of inorganic salt, water and DES, respectively; Wtotal is the sum of Wsalt, Wwater, and WDES.

進一步比較了不同無機鹽（K2HPO4和K3PO4）對ChCl/Buta 相圖形成能力的影響. 由圖4 可知，ChCl/Buta-K2HPO4的成相能力強于ChCl/Buta-K3PO4.

2.3 DES-ATPS萃取條件的優化

2.3.1 DES類型的選擇 制備了以ChCl為氫鍵受體的7種DES，雖然氫鍵受體相同，但由于氫鍵供體的極性、 親水性等性質的不同，制備得到的DES性質也不同，影響了萃取溶劑與目標物之間的相互作用，進而影響萃取率［32］. 考察了7種不同DES對尿液中雜環胺回收率的影響，平行測定3次. 如圖5所示，當使用ChCl/Xyl，ChCl/Glu和ChCl/Sor為萃取劑時，雜環胺的回收率均低于40%，其原因可能是氫鍵供體［木糖醇、D-（+）-葡萄糖、D-山梨醇］含有—OH的數量較多，形成的DES（ChCl/Xyl，ChCl/Glu和ChCl/Sor）黏度較大，阻礙了ChCl/ATPS體系與雜環胺目標分子之間的相互作用，故而出現較低的回收率. 相比之下，ChCl/Buta體系表現出較好的雜環胺回收率，且結合雙水相相圖的分相能力，實驗選擇DES類型為ChCl/Buta.

Fig.5 Effect of the type of DES on recovery

2.3.2 DES用量的選擇 DES的用量直接影響到萃取效率，是能否將目標分析物提取完全的關鍵性因素. 考察了不同DES使用量（50～350 mg）對雜環胺回收率的影響，平行測定3 次，結果如圖6所示. 結果表明，隨著DES使用量的不斷增加，回收率也不斷升高，當DES 使用量增加到200 mg 時，回收率達到最大值； 再繼續增大DES 的使用量，回收率略有下降，這可能是隨著DES使用量的進一步增加，DES 相的黏度也會增加，不利于HAAs向DES相轉移，從而導致回收率的輕微下降. 因此，實驗選擇ChCl/Buta使用量為200 mg.

Fig.6 Effect of the amount of DES on recoverySpiked concentration in 1 mL urine sample: IQ, 1.5 μg/mL; IQ[4,5-b], 3.0μg/mL; Harman, 1.5 μg/mL; Norharman, 1.5 μg/mL; Phe-P-1, 3.0 μg/mL.

2.3.3 無機鹽類型的選擇 無機鹽的加入能夠促進雙水相的形成，不同種類的鹽與DES的成相能力不同，進而影響目標分析物的提取效率［33］. 首先，考察了4 種含鉀無機鹽（K2HPO4，KCl，K3PO4和KH2PO4）與ChCl/Buta的成相能力. 實驗中發現，KH2PO4和KCl與ChCl/Buta均不能形成雙水相體系，可能是因為KH2PO4和KCl的水溶性較低. 然后，重點考察了ChCl/Buta-K2HPO4和ChCl/Buta-K3PO4兩種雙水相體系對雜環胺回收率的影響，平行測定3次，結果如圖7所示. 結果表明，ChCl/Buta-K2HPO4雙水相體系中雜環胺回收率稍高于ChCl/Buta-K3PO4體系. 另外，結合相圖可知K2HPO4比K3PO4具有更強的成相能力，且得到體積相同的DES 相時，K2HPO4的用量少于K3PO4. 綜合考慮，實驗選擇K2HPO4作為雙水相的無機鹽.

Fig.7 Effect of the type of inorganic salt on recoverySpiked concentration in 1 mL urine sample: IQ, 1.5μg/mL; IQ[4,5-b], 3.0 μg/mL; Harman, 1.5 μg/mL;Norharman, 1.5 μg/mL; Phe-P-1, 3.0 μg/mL.

2.3.4 無機鹽使用量的選擇 無機鹽的用量決定著是否能形成雙水相體系，同時也會降低目標物在水相的溶解度，促使更多的目標物轉移到DES 相，進而影響萃取效率［34］.考察了不同K2HPO4的使用量（0.2～1.4 g）對雜環胺回收率的影響，平行測定3 次. 如圖8 所示，當K2HPO4加入量增加至0.4 g時，還不能形成DES-ATPS 雙水相體系. 當加入量為0.6 g 時，開始形成雙水相體系，呈現清晰的兩相，此時雜環胺回收率急劇增加. 當K2HPO4達到0.8 g 時，雜環胺回收率達到最大值. 當K2HPO4使用量繼續增加至1.2 g，雜環胺回收率趨于平穩，可能是因為DES 相中DES 含量趨于飽和，萃取效率增加緩慢； 當K2HPO4用量大于1.2 g時，可能是因為溶液體系黏度的增加不利于HAAs向DES相擴散，導致萃取效率略有下降. 因此，實驗選擇無機鹽用量為0.8 g.

Fig.8 Effect of the amount of K2HPO4 on recovery

2.3.5 pH值的選擇 由于HAAs是兩性物質，體系的pH值影響著溶液中HAAs的存在狀態，進而影響其萃取效率［35］. 實驗中通過在尿液樣品中加入適量的氨水來調節體系的pH 值，考察了體系pH 值從7.5 到11.5 對雜環胺回收率的影響，平行測定3 次，結果如圖9 所示. 結果表明，當體系的pH=10.5時，雜環胺的回收率最高，這可能是因為此時雜環胺以游離堿形式存在于樣品溶液中，更容易被萃取到DES相中. 因此，實驗選擇體系pH值為10.5.

Fig.9 Effect of pH value of sample solution on recovery

2.3.6 萃取時間的選擇 采用渦旋振蕩輔助的方式提取目標物，渦旋振蕩能夠促進DES與樣品溶液充分接觸，促進目標物向DES相轉移，進而提高雜環胺的萃取效率. 渦旋萃取時間太短會導致雜環胺提取不完全，時間過長又會增加時間成本［36］. 考察了不同萃取時間（1～11 min）對雜環胺回收率的影響，平行測定3次. 如圖10所示，當萃取時間從1 min增加到3 min時，雜環胺回收率略有增加，繼續增加萃取時間，回收率變化不大. 因此，實驗選擇萃取時間為3 min.

Fig.10 Effect of vortex time on recovery

2.3.7 離心時間的選擇 離心可以促進DES相與水相之間形成清晰穩定的界面，實驗考察了不同離心時間（1～11 min）對界面清晰度的影響，平行測定3 次. 結果表明，當離心時間為3 min 時，上下兩相界面即能達到清晰.

2.4 方法學考察

通過測定線性、 檢出限（LODs）、 定量限（LOQs）、 準確度和精密度，評估了所建立方法的分析性能，結果列于表2. 以待測樣品中雜環胺的濃度為橫坐標（x），相應的峰面積為縱坐標（y）繪制工作曲線，其相關系數（R2）均大于0.999，表明該方法線性關系良好. 分別用3倍和10倍信噪比（S/N）確定方法的檢出限（LODs）和定量限（LOQs），分別為0.020～0.097 ng/g和0.19～0.39 ng/g.

Table 2 Analytical performances of the method

通過日內和日間重復性實驗考察了方法的精密度，5種雜環胺的日內和日間相對標準偏差（RSD）分別低于2.9%和3.2%，表明該方法具有較好的精密度和穩定性.

通過加標回收率考察了方法的準確性，結果表明，在低、 中、 高3個加標水平下雜環胺的回收率分別為81.9%～100.6%，82.5%～106.2%和84.0%～99.5%，均處于70%～120%之間，表明該方法準確性良好.

2.5 方法對比

將本文方法的加樣回收率、 檢出限、 精密度和有機溶劑消耗量等參數與文獻報道的其它方法進行了比較，結果列于表3. 結果表明，LLE-SPE串聯法和兩步固相萃取串聯法需使用大量的有機溶劑，預處理過程繁瑣且耗時，而本文方法不使用有機溶劑、 操作簡單且前處理時間短； 磁性固相萃取法中磁性材料的制備步驟繁瑣、 操作麻煩、 耗時長，本文方法中DES合成簡單，成本低廉且更綠色環保.

此外，表3數據還表明，DES-APTS方法具有更好或相當的準確度和精密度，檢出限高于LC-MS測定的檢出限，但在可接受的范圍內，符合相關標準； 與LC-MS 相比，HPLC 儀器更易實現普及. 以上結果驗證本文方法具有快速、 簡便、 單樣品成本低及不使用有機溶劑等特點，適用于尿液樣品中HAAs分析.

Table 3 Comparison of the present method with other methods

2.6 實際樣品分析

利用本文方法對20份非吸煙者和20份吸煙者尿液樣本進行了分析，結果表明，僅在其中2份吸煙者尿液中檢測出Harman，但均低于定量限.

3 結 論

建立了一種低共熔溶劑/無機鹽雙水相萃取（DES-APTS）結合超高效液相色譜法測定吸煙者和非吸煙者尿液中5種雜環胺含量的方法. 首先，以氯化膽堿為氫鍵受體，與不同的氫鍵供體制備7種不同的DES，利用FTIR和1H NMR對其結構進行了表征，并討論了不同的氫鍵供體對成相能力的影響規律； 其次，通過單因素實驗確定了DES-APTS體系的最優萃取條件，并評價了其分析性能. 結果表明，本文方法具有良好的線性、 準確性和重現性. 與文獻報道的方法相比，本文方法具有環境友好、 操作簡單、 快速及單樣品成本低等特性，為評估香煙煙氣中雜環胺的暴露水平提供一種有效方法，為卷煙危害性評價提供新的研究思路，同時拓寬了DES-ATPS體系的應用領域. 此外，低共熔溶劑合成簡單，成本低廉且更綠色環保，可作為離子液體的潛在替代品，在樣品前處理領域具有良好的發展前景和應用潛力.