復(fù)方石榴皮藥膜對金黃地鼠皮脂腺斑形態(tài)學(xué)及雄激素受體表達(dá)的影響*

張娟娟，朱飛云，吳淑輝，謝小麗，楊逸璇，朱明芳

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖南 瀏陽 410300；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

痤瘡是一種毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性疾病，患病年齡段覆蓋兒童到中年兩極[1]，其中青少年發(fā)病率最高。痤瘡好發(fā)于面、胸背等皮脂分泌旺盛部位，愈合后易遺留凹陷性或增生性瘢痕，具有損容性。痤瘡病因機(jī)制復(fù)雜。患者進(jìn)入青春期后腎上腺及性腺的發(fā)育導(dǎo)致雄激素分泌增加。刺激皮脂腺功能增強(qiáng)，皮脂分泌增加是公認(rèn)的痤瘡發(fā)生發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)[2]。因此，減少雄激素分泌，抑制皮脂腺功能的亢進(jìn)，調(diào)控皮脂穩(wěn)態(tài)是治療痤瘡的重要思路和手段。近年來，較之西藥外用藥物，中藥外治以其簡便效廉，不良反應(yīng)小，患者接受程度高，臨床應(yīng)用前景廣闊[3]，在輕中度痤瘡治療中的地位愈發(fā)凸顯，是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)[4]。

復(fù)方石榴皮藥膜由石榴皮、桑葉、荷葉、茉莉花、紫蘇葉、綠茶組成，具有清熱解毒、祛脂化濁、消腫祛瘀功效。前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，將上藥制成中藥粗粉后清洗痤瘡患者面、胸背部皮膚，能明顯改善皮膚油膩感，減少皮脂分泌，增強(qiáng)祛痘療效。本研究旨在探究復(fù)方石榴皮藥膜對金黃地鼠痤瘡模型的治療作用及對雄激素受體（AR）表達(dá)的影響，以期為臨床使用提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性金黃地鼠15只，7周齡，體質(zhì)量110～130 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0011。實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號：SYXXK（湘）2020-0015。飼養(yǎng)條件：所有實(shí)驗(yàn)動物同一飼舍內(nèi)分籠圈養(yǎng)，12 h光照及12 h黑夜并保持20 ℃恒溫的人工環(huán)境中喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司動物倫理委員會審查批準(zhǔn)，審批號：IACUC-2021（5）037。所有操作均嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動物管理相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物與試劑 復(fù)方石榴皮藥膜由石榴皮、桑葉、荷葉、茉莉花、紫蘇葉組成，以上中藥飲片由安徽盛海堂中藥飲片有限公司生產(chǎn)，批號分別為2021101081、2021100375、2021100545、2021110375、2021110541。中藥經(jīng)瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院中藥師謝宗明鑒定為正品。研極細(xì)粉后過120目篩，制成生藥粉劑，各組分通過篩選取得最佳配比，混勻瓶裝，備用。綠茶（長沙縣金井茶廠出品，食品生產(chǎn)許可證：SC11443012100294）。0.025%維A酸乳膏（商品名：迪維，規(guī)格：15 g/支，國藥準(zhǔn)字：H50021817，重慶華邦制藥有限公司）。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：718091）；AR抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：P10275）；通用二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：SP-9000）。

1.3 主要儀器 正置熒光顯微鏡（日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社，型號：奧林巴斯BX53）；全封閉式組織脫水機(jī)（達(dá)科為[深圳]醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號：HP300）；輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)[上海]貿(mào)易有限公司，型號：RM2235）；生物組織攤烤片機(jī)（武漢漢谷醫(yī)療科技有限公司，型號：HK-4）；生物組織石蠟包埋機(jī)（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號：YB-8LF）；全自動免疫組化染色儀（德國徠卡儀器有限公司，型號：Bond-Max）；冰箱（青島海爾股份有限公司，型號：BCD-226SKA）；游標(biāo)卡尺（上海量具刃具廠，規(guī)格：0～200 mm）；強(qiáng)光手電（深圳市神火照明有限責(zé)任公司，型號：C8-XPE）。

2 方 法

2.1 分組與給藥 15只受試動物隨機(jī)分為空白組、陽性對照組（0.025%維A酸乳膏組）、藥膜組，每組5只。空白組外涂蒸餾水，不予任何藥物處理。陽性對照組外涂0.025%維A酸乳膏，1 mL/次，給藥后予遮光措施處理以防止藥物見光分解。藥膜組，每次使用時取10 g生藥粉末以綠茶茶汁調(diào)制成藥膜，將泥膏狀藥膜涂抹于無菌敷料上，2 mL/次，通過醫(yī)用無紡布貼固定到金黃地鼠皮脂腺斑處，30 min后洗去。各組給藥方法均為外用，給藥部位為雙側(cè)皮脂腺斑處，2次/d，連續(xù)用藥28 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 皮脂腺斑面積大小 干預(yù)開始后第0、14、28天，剃毛器剃除皮脂腺斑及周圍皮膚毛發(fā)后，使皮脂腺斑充分暴露，金黃地鼠取俯臥位，在強(qiáng)光照射下，用照相機(jī)以同一焦距記錄皮脂腺斑大體照片，游標(biāo)卡尺分別測量并記錄左、右兩側(cè)皮脂腺斑的最大橫徑（transverse diameter，DT）mm、最大縱徑（longitudinal diameter，DL）mm，以DT×DL值計算皮脂腺斑面積，取兩側(cè)皮脂腺斑面積大小之和進(jìn)行觀察比較。

2.2.2 皮脂腺斑組織病理學(xué) 末次給藥24 h后，剪取金黃地鼠左側(cè)皮脂腺斑組織，放入10%甲醛固定液固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后，鏡下觀察皮脂腺斑組織學(xué)形態(tài)變化。參考文獻(xiàn)修訂皮脂腺斑厚度變化的計算標(biāo)準(zhǔn)[5-6]：皮脂腺體積無明顯變化，厚度較厚，重疊腺葉數(shù)0葉（-）；皮脂腺體積略有減小，厚度稍變薄，重疊腺葉數(shù)1葉（+）；皮脂腺體積有所縮小，厚度變薄，重疊腺葉數(shù)2～3葉（++）；皮脂腺體積顯著縮小，厚度顯著變薄，重疊腺葉數(shù)≥4葉（+++）。

2.2.3 免疫組織化學(xué)測量AR值 免疫組化AR陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：染色區(qū)域?yàn)槠ぶ偌?xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中顯示棕黃色顆粒。每張切片選取3個具有代表性的高倍視野（×200），根據(jù)染色呈陽性皮脂腺細(xì)胞的分布情況劃分為：未見陽性細(xì)胞或者陽性細(xì)胞比例＜10%為陰性（-）；陽性細(xì)胞所占比例10%～≤25%為弱陽性（+）；陽性細(xì)胞所占比例＞25%且≤50%為陽性（++）；陽性細(xì)胞所占比例＞50%為強(qiáng)陽性（+++）。參考文獻(xiàn)制定計數(shù)轉(zhuǎn)換標(biāo)準(zhǔn)[6]：（-）=0，（+）=1，（++）=2，（+++）=3。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料若符合正態(tài)分布，采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示。重復(fù)測量計量資料采用重復(fù)測量方差分析。3個及以上獨(dú)立組的比較采用單因素方差分析，若滿足方差齊性，兩兩比較采用LSD法，若不滿足方差齊性，則采用塔姆黑尼法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組金黃地鼠皮脂腺斑面積比較 第28天，肉眼觀察可見陽性對照組、藥膜組金黃地鼠的皮脂腺斑大體上小于空白組。第0天，空白組、陽性對照組、藥膜組皮脂腺斑面積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3組金黃地鼠皮脂腺斑面積總體比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），即組間效應(yīng)不明顯。所有金黃地鼠皮脂腺斑面積在不同時間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即存在時間效應(yīng)。3組金黃地鼠接受不同干預(yù)方法和時間之間存在交互效應(yīng)（P＜0.05），即隨時間的延長，空白組和陽性對照組、藥膜組皮脂腺斑面積大小變化趨勢不同。隨著時間變化，空白組皮脂腺斑面積逐漸增大，陽性對照組和藥膜組皮脂腺斑面積先增大后縮小。陽性對照組第28天與第14天比較，皮脂腺斑面積減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。藥膜組第14天、第28天分別與給藥前比較，皮脂腺斑面積減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。第28天，藥膜組與陽性對照組皮脂腺斑面積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖1～2、表1）

表1 3 組金黃地鼠皮脂腺斑面積比較 （±s，mm2）

表1 3 組金黃地鼠皮脂腺斑面積比較 （±s，mm2）

組別 n 第0天 第14天 第28天 F P空白組 5 90.30±13.21 103.02±9.90 123.47±17.04 7.464 0.008陽性對照組 5 88.66±20.88 112.91±4.80 98.05±6.23 4.502 0.035藥膜組 5 93.29±11.00 122.40±10.58 112.11±10.87 9.359 0.004 F 0.113 6.089 5.442 P 0.894 0.015 0.021

圖1 給藥28 d 各組金黃地鼠皮脂腺斑大體圖

圖2 皮脂腺斑面積交互效應(yīng)輪廓圖

3.2 各組金黃地鼠皮脂腺斑組織形態(tài)及厚度比較 第28天，空白組皮脂腺腺體體積大，數(shù)量多，呈多層分葉狀，排列厚且緊密整齊；陽性對照組皮脂腺腺體體積與空白組對比明顯變小，厚度較空白組明顯變薄，腺葉數(shù)減少，排列松散；藥膜組皮脂腺腺體體積明顯減小，部分腺體萎縮，分葉狀結(jié)構(gòu)較空白組減少，厚度較空白組明顯變薄，排列明顯疏松，個別視野有液化小囊形成。與空白組比較，陽性對照組及藥膜組皮脂腺斑厚度明顯變薄，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性對照組與藥膜組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖3、表2）

表2 第28 天各組金黃地鼠皮脂腺斑厚度、AR 比較（±s）

表2 第28 天各組金黃地鼠皮脂腺斑厚度、AR 比較（±s）

組別 n 皮脂腺斑厚度/mm AR空白組 5 2.60±0.55 2.40±0.55陽性對照組 5 1.60±0.55 1.20±0.45藥膜組 5 1.00±0.71 0.60±0.55 F 8.909 15.750 P 0.004 0.000

圖3 第28 天各組金黃地鼠皮脂腺斑病理變化比較（HE 染色）

3.3 各組金黃地鼠皮脂腺斑表達(dá)AR比較 第28天，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，AR陽性區(qū)域?yàn)槠ぶ偌?xì)胞核。與空白組比較，陽性對照組及藥膜組AR表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；陽性對照組與藥膜組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖4、表2）

圖4 第28 天各組AR 免疫組化染色結(jié)果

4 討 論

痤瘡是累及毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于面、胸背等皮脂分泌旺盛部位。皮脂腺產(chǎn)生的脂類混合物稱為皮脂，痤瘡發(fā)病的重要因素是皮脂生成增多、含量增加，皮脂成分改變[7-8]。皮脂的分泌與雄激素調(diào)控的皮脂腺功能密切相關(guān)。調(diào)節(jié)雄激素水平，抑制皮脂腺功能亢進(jìn)，維護(hù)皮脂穩(wěn)態(tài)在痤瘡防治中具有重要作用。目前外用較廣泛的維A酸類藥物、抗生素類藥膏，因其容易導(dǎo)致皮膚干燥、灼熱等不良反應(yīng)及產(chǎn)生耐藥性，一定程度上限制了其使用。因此，迫切需要開發(fā)天然安全無毒的中藥抑脂祛痘產(chǎn)品解決痤瘡患者油脂分泌過多的煩惱，為臨床治療痤瘡提供新的手段。

中醫(yī)外治專著《理瀹駢文》提出：“外治之理，即內(nèi)治之理，外治之藥亦即內(nèi)治之藥。所異者，法耳。”該觀點(diǎn)為中醫(yī)外治法提供了理論依據(jù)。朱明芳教授跟師湖湘中醫(yī)皮病取象論治學(xué)派創(chuàng)始人歐陽恒教授十余年，學(xué)派取象論治法則之一的“以皮治皮”法是歐陽恒教授的主要臨證學(xué)術(shù)思想。朱明芳教授盡得其傳，臨床運(yùn)用以皮類中藥石榴皮為主的組方外治于面部痤瘡，在調(diào)控皮脂穩(wěn)態(tài)方面收效頗佳[9-11]。復(fù)方石榴皮藥膜組方以石榴皮為主藥，均為常見的藥食同源花葉類植物，藥性溫和無毒，使用安全。方中石榴皮，性味酸澀，具有收斂止血?dú)⑾x之效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)石榴皮有效成分石榴皮多酚具有抑制痤瘡丙酸桿菌活性、抗瘢痕、抗金黃地鼠皮脂腺斑增生、調(diào)控皮脂穩(wěn)態(tài)失衡的作用[12-14]。荷葉味苦、澀，性平，清暑利濕，升發(fā)清陽，涼血止血；桑葉性偏涼，味甘、苦、寒，有疏風(fēng)清熱解毒、涼血止血等功效。桑葉、荷葉可加強(qiáng)脂質(zhì)代謝，增強(qiáng)脾胃運(yùn)化，以清熱解毒化濁增強(qiáng)療效[15]。茉莉花味辛、甘，性溫，具有解毒消腫、活血散瘀等效。紫蘇葉辛、溫，主解表、行氣、和血。兩藥氣味芳香，合用可明顯改善機(jī)體糖代謝[16]。現(xiàn)代研究顯示桑葉、荷葉、茉莉花、紫蘇葉均具有降脂、抑菌、抗病毒、抗炎、抗敏等作用[17-20]。綠茶汁液治療痤瘡效果顯著，對面部痤瘡細(xì)菌具有抑制作用且作用隨著汁液濃度的增加而增強(qiáng)[21]。

痤瘡在中醫(yī)學(xué)屬“肺風(fēng)粉刺”“面皰”等范疇。《外科正宗》言：“粉刺屬肺……總皆血熱郁滯不散。”《素問·至真要大論篇》謂“諸痛癢瘡，皆屬于心”。肺主皮毛，心主血脈。疏解客于皮毛的外邪、清解郁于心血的火熱之邪是從臟腑辨證的角度分析論治痤瘡的依據(jù)。本研究組方中的皮類藥石榴皮以皮治皮，以皮走皮，引藥直達(dá)病所。花、葉類藥茉莉花、桑葉、荷葉、紫蘇葉質(zhì)輕味辛，輕揚(yáng)浮散、能宣能透，具有輕疏靈動之性。輕者，輕解升清；疏者，疏動氣機(jī)，和調(diào)氣血。且辛散藥物具有加強(qiáng)外用藥物滲透的作用[22]。全方皮、花、葉合用，用于治療好發(fā)于面部肌膚的痤瘡療效明顯，可達(dá)宣暢、解毒、化濕、泄?jié)帷⑸鲋Α?/p>

金黃地鼠側(cè)腹部皮脂腺斑是目前公認(rèn)的可作為研究皮脂腺增生活性的較理想的動物模型[23]。皮脂腺斑的真實(shí)體積大小變化與藥物的作用強(qiáng)弱呈較好的相關(guān)性[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性對照組、藥膜組用藥后金黃地鼠皮脂腺斑面積縮小，藥膜組與陽性對照組金黃地鼠皮脂腺斑面積大小相當(dāng)。組織病理學(xué)觀察顯示，復(fù)方石榴皮藥膜干預(yù)能使金黃地鼠皮脂腺體積減小、厚度變薄、腺體層數(shù)減少、腺體萎縮等組織結(jié)構(gòu)改變，提示復(fù)方石榴皮藥膜對皮脂腺功能有抑制作用。

AR由配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和N端調(diào)控結(jié)構(gòu)域組成，屬于類固醇/核受體超家族[25]。AR可刺激皮脂腺皮脂過分泌，在調(diào)節(jié)皮脂分泌中起重要作用。AR能促進(jìn)痤瘡炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[26]，但具體機(jī)制尚不明確，可能與其調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2）的活性，使皮脂腺的分泌處于平衡有關(guān)[27]，也可能與其增加皮脂固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs）的表達(dá)，刺激皮脂腺的皮脂分泌等因素有關(guān)[28]。因此，局部抑制雄激素受體可能是一種治療痤瘡有效的方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方石榴皮藥膜外敷于金黃地鼠皮脂腺斑后雄激素受體表達(dá)量降低，故局部雄激素受體一定程度上受到抑制，進(jìn)而對皮脂腺細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用減少了皮脂分泌從而達(dá)到治療效果。

綜上所述，復(fù)方石榴皮藥膜對金黃地鼠痤瘡模型治療效果確切，能有效減輕病理損傷，抑制皮脂腺增生。其作用機(jī)理可能與其抑制雄激素受體表達(dá)相關(guān)。