烏頭湯聯合甲氨蝶呤治療大鼠類風濕關節炎的療效及其與p38MAPK通路的相關性*

吳 丹，李潔芳，劉 君

（長沙市第四醫院，湖南 長沙 410006）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫疾病，可能與自身免疫、遺傳、感染、吸煙等因素有關，但確切病因還不明確，尚無有效的預防措施[1]。臨床主要采用非甾體抗炎藥、糖皮質激素和免疫抑制劑等藥物對RA進行治療，但胃腸道反應、肝功能損傷等副作用明顯[2]。其中甲氨蝶呤是治療RA的一線藥物。烏頭湯（Wutou decoction，WTD）可通過減少炎癥因子的釋放，調節血液免疫因子水平，來減輕關節疼痛。WTD治療RA的臨床療效佳，但其作用機制尚未完全闡明[3]。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）通路是決定滑膜炎癥嚴重程度的重要因素[4]。故本研究擬探討WTD聯合甲氨蝶呤治療大鼠RA的療效及其與p38MAPK通路的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 75只6周齡雄性Wistar大鼠，購自湖南師范大學動物中心，動物生產許可證批號：SYXK（湘）2019-0008，體質量為（210.65±25.56）g。實驗過程中所有大鼠均處在無病原體條件下，恒溫（25±2）℃，相對濕度（45%～55%），12 h光/12 h暗循環飼養籠，大鼠可隨意飲食。本研究通過長沙市第四醫院倫理委員會審核批準（倫理審查批號：2018-0224）。

1.2 藥物與試劑 WTD：制川烏，白芍，麻黃，炙甘草，黃芪。中藥飲片均于本院中藥房采購，由藥學部鄧菲藥師鑒定為正品。制川烏、白芍、麻黃、炙甘草、黃芪的質量比例為6∶9∶9∶9∶9。上述藥物混合，進行2次煎煮，煎煮時間均為1.5 h，過濾，合并2次濾液。旋蒸濃縮至所需體積，質量濃度為0.4 g/mL，藥液放入4°C冰箱備用。甲氨蝶呤（湖南正清制藥集團股份有限公司，批號：20210405）。將甲氨蝶呤片磨研成粉末，加入無菌蒸餾水混合均勻，配制成質量濃度為0.2 mg/mL的藥物混懸液。

牛Ⅱ型膠原（北京博蕾德生物科技有限公司，批號：20021）；完全弗氏佐劑（上海偉進生物科技有限公司，批號：08642852）；一抗（兔抗）（批號：HZ-001）、二抗（羊抗兔）（批號：HZ-E5230）均購自上海滬震實業有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶聯免疫吸附試驗（ELIAS）試劑盒（批號：ER1393）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號：EY-18442）均購自北京博奧森生物技術有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液（批號：AR1071）、二甲苯（批號：SA2024）均購自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol試劑（批號：488008）；細胞質和核RNA純化試劑盒（批號：2692521）、RevertAid H Minus First Strand cDNA合成試劑盒（批號：K1651）、SYBR Green PCR Master Mix（批號：14001013）均購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 主要儀器 500 g天平（上海浦春設備有限公司，型號：JY502）；精密天平（上海精密科學儀器公司，型號：JA31002）；足趾容積測量儀（北京眾實迪創科技發展有限責任公司，型號：ZS-TVM）；超速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H-2050R）；酶標儀（美國BIOTEK公司，型號：ELX-800）；雙垂直蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24DN）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time PCR）儀（美國Biosystems公司，型號：Q5-7500型）。

1.4 分組與造模 75只大鼠按照隨機數字表法分為空白組（15只）、RA模型組（15只）、甲氨蝶呤組（15只）、WTD組（15只）、WTD+甲氨蝶呤組（15只）。除空白組外的大鼠均進行膠原誘導造模。參照文獻中方法[5]并進行改良，將牛Ⅱ型膠原（10 mg）與0.1 mol/L醋酸水（5 mL）混合均勻，配制成質量濃度為2 mg/mL的溶劑，置于4 ℃的環境下過夜，將5 mL上述溶劑與5 mL完全弗氏佐劑（CFA）混合均勻，置于4 ℃環境中直至完全乳化，配制成質量濃度為1 mg/mL的乳化液，給大鼠注射乳化液進行初次免疫，分別從尾根部選取1個點、后足掌選取1個點、背部選取3個點進行皮下注射，0.2 mL/只。初次免疫后第7天再次進行皮下注射乳化液?？瞻捉M大鼠在相同的時間皮下注射等劑量的生理鹽水。造模成功標準：四肢足爪顯現嚴重腫脹，其踝關節直徑增長幅度大于2 mm，后爪體積增大≥0.8 mL。各組大鼠均造模成功。

1.5 實驗給藥 參照《藥理實驗方法學》[6]中的等效劑量系數折算法進行藥物灌胃。甲氨蝶呤組大鼠灌胃甲氨蝶呤，1mg/（kg·d），1次/d，持續28 d；WTD組大鼠灌胃WTD，9.8 g/（kg·d），1次/d，持續28 d；WTD+甲氨蝶呤組分別予WTD[9.8 g/（kg·d）]和甲氨蝶呤[1 mg/（kg·d）]灌胃，1次/d，持續28 d；空白組及RA模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，1次/d，持續28 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 大體觀察和組織學觀察 （1）大體觀察：取大鼠右后踝關節，用顯微鏡觀察關節結構情況，進行Pelletier大體評分[7]。關節面完整，色澤正常為0分；關節面粗糙并有小的裂隙為1分；關節面糜爛并有軟骨缺損為2分；關節面潰瘍形成并有缺損達軟骨深層為3分；軟骨剝脫及軟骨下骨質暴露為4分。（2）關節組織病理學觀察：使用10%水合氯醛溶液腹腔注射（0.3 mL/100g）麻醉大鼠，使用皮剪剝離大鼠膝關節皮毛，并逐層暴露其膝關節，隔斷周圍韌帶，暴露其膝關節腔，在盡量保證其完整的情況下用手術刀片分離膝關節滑膜后，放入液氮中保存備用，并切下大鼠踝關節，將取出的組織均放入4%多聚甲醛中室溫保存。對組織進行HE染色切片，觀察其病理改變情況，并通過光鏡軟骨檢測評價標準（Mankin）[8]對大鼠的踝關節進行組織學評分。①軟骨結構：正常計0分，表面不規則計1分，血管翳形成和表面不規則計2分，裂隙進入過渡層計3分，裂隙進入輻射層計4分，裂隙進入鈣化層計5分，結構完全破壞計6分；②軟骨細胞：正常計0分，彌漫性細胞增加計1分，局部細胞增加計2分，細胞數目明顯減少計3分；③軟骨基質染色：正常計0分，輕度減少計1分，中度減少計2分，重度減少計3分，無著色計4分；③潮線完整性：完整計0分，被血管破壞計1分。

1.6.2 大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA及p38MAPK mRNA表達水平 采用聚合酶鏈反應（PCR）檢測Ⅱ型膠原mRNA及P38MAPK mRNA表達。使用TRIzol試劑從大鼠軟骨細胞中分離總RNA。使用細胞質和核RNA純化試劑盒提取RNA。然后通過苯酚-氯仿提取純化RNA，并使用RevertAid H Minus First Strand cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix在PCR儀中進行定量實時PCR。β-actin為參照表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.3 滑膜組織p38MAPK蛋白表達水平 采用Western blotting法檢測滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量。取出“1.6.1”中保存的滑膜組織，在各組滑膜組織中加入組織裂解液（4 ℃預冷）；Vortex混勻，冰上裂解30 min；4 ℃，12 000 r/min（離心半徑為10 cm）離心30 min后，取上清液，采用Bradford方法測蛋白濃度，-80 ℃保存備用。SDS-PAGE電泳：20 μg總蛋白進行12%SDS-PAGE電泳分離，100 V電泳2 h。Bio-Rad：100 V，使蛋白質轉移至硝酸纖維素濾膜。印跡膜用5%脫脂牛奶（封閉液）室溫封閉2 h。印跡膜與一抗（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，10 min/次。將膜與HRP標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1h，TBST緩沖液洗膜3次，10min/次。ECL試劑發光，顯影及定影。以β-actin（1∶800）為內參。實驗重復3次。用Quantity one軟件分析p38MAPK在大鼠滑膜組織中的表達，計算相對表達量。

1.6.4 血清TNF-α、IL-6的水平 各組大鼠給藥28 d后，取尾靜脈血2 mL，3 500 r/min（離心半徑為10 cm）離心15 min，吸取上層血清標本。采用ELIAS試劑盒檢測血清TNF-α、IL-6的水平。

1.7 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗或SNK-q檢驗，相關分析采用Pearson線性相關分析法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠踝關節Pelletier評分和Mankin評分比較 空白組大鼠踝關節未出現腫脹；RA模型組大鼠踝關節明顯腫脹，并伴有跛行；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠踝關節腫脹情況較模型組輕，未見跛行。RA模型組、甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠踝關節Pelletier和Mankin評分均高于空白組（P＜0.05）；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠踝關節Pelletier和Mankin評分均低于RA模型組（P＜0.05）；WTD+甲氨蝶呤組大鼠踝關節Pelletier和Mankin評分低于WTD組、甲氨蝶呤組（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠踝關節Pelletier評分和Mankin評分比較（±s，n=15）

2.2 各組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量比較 RA模型組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量低于空白組（P＜0.05）；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量高于RA模型組（P＜0.05）；WTD+甲氨蝶呤組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量高于WTD組、甲氨蝶呤組（P＜0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量比較（±s，n=15）

2.3 各組大鼠軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量比較RA模型組大鼠軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量高于空白組（P＜0.05）；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量均低于RA模型組（P＜0.05）；WTD+甲氨蝶呤大鼠軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量低于WTD組、甲氨蝶呤組（P＜0.05）。（見圖3）

圖3 各組大鼠軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量比較（±s，n=15）

2.4 各組大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量比較 RA模型組大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量高于空白組（P＜0.05）；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量均低于RA模型組（P＜0.05）；WTD+甲氨蝶呤組大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量低于WTD組、甲氨蝶呤組（P＜0.05）。（見圖4～5）

圖4 各組大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白相對表達量比較（±s，n=15）

圖5 大鼠滑膜組織p38MAPK蛋白表達Western blotting圖

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 RA模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平高于空白組（P＜0.05）；甲氨蝶呤組、WTD組、WTD+甲氨蝶呤組大鼠血清TNF-α、IL-6水平均低于RA模型組（P＜0.05）；WTD+甲氨蝶呤組大鼠血清TNF-α、IL-6水平低于WTD組、甲氨蝶呤組（P＜0.05）。（見圖6）

圖6 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 （±s，n=15）

2.6 血清TNF-α、IL-6水平與軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量相關性分析 各組血清TNF-α、IL-6與軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量呈正相關（P＜0.05）。（見表2、圖7～8）。

表2 血清TNF-α、IL-6水平與軟骨細胞p38MAPK mRNA相對表達量的相關分析

圖7 血清TNF-α水平與p38MAPK mRNA相對表達量相關分析散點圖與直線擬合

圖8 血清IL-6水平與P38MAPK mRNA相對表達量相關分析散點圖與直線擬合

3 討 論

RA是一種以關節滑膜炎癥為主要病理基礎的自身免疫疾病，其關節病理表現為滑膜細胞大量增生。近年數據顯示其致殘率較高，產生心血管疾病等合并癥的概率較高[9]。甲氨蝶呤治療RA可取得較好的療效，但仍存在由于藥物不耐受而導致療效不佳的情況，因此探索更好的治療藥物對RA患者的預后具有積極意義[10]。近年來，中醫學在RA的治療上有頗多進展，可通過祛邪通絡、補益肝腎等治法調節機體陰陽平衡，達到控制關節癥狀的目的[11-12]。WTD出自《金匱要略》，主治寒濕歷節，可改善RA患者關節疼痛、腫脹等癥狀[13]。目前WTD治療RA的作用機制尚不明確。p38MAPK信號通路是參與RA炎癥發展的重要途徑，p38MAPK信號通路在RA慢性炎癥的誘導及維持中起重要作用，故本研究旨在探討WTD聯合甲氨蝶呤治療大鼠RA的療效及其與p38MAPK通路的相關性。

中醫學將RA歸屬為“尪痹”“痹病”等范疇，治療以“寒者熱之”“治寒以熱”為主要原則[14]。WTD的溫經散寒力強，并能祛風除濕?！督饏T要略》指出：“病歷節，不可屈伸，疼痛，烏頭湯主之。”其原方由川烏、麻黃、黃芪、白芍和甘草組成，具有溫經散寒、祛風除濕之效[15]。方中烏頭為君藥，能升能降，通經絡，利關節，有溫經散寒、除濕止痛之功；麻黃為臣藥，有宣散透表、祛寒濕之效。二者配伍，同氣相求，藥力專宏，外能宣表通陽達邪，內可透發凝結之寒邪，外攘內安，痹痛自無。白芍宣痹行血，黃芪益氣固衛。兩者合用既助麻黃、烏頭溫經止痛，亦制麻黃過散之性，為佐藥。炙甘草為使藥，緩急止痛。諸藥相伍，使寒濕去而陽氣宣通，關節疼痛解除而屈伸自如。烏頭具有鎮痛作用，可以減輕疼痛[16]；炙甘草中的甘草酸和黃芪中的黃芪苷具有抗炎作用，可以減輕炎癥反應，并且炙甘草中的甘草酸還具有免疫調節作用，可以調節免疫系統功能，促進機體免疫力恢復[17]；白芍中的芍藥苷可以抑制血管內皮細胞增殖和炎癥反應，從而減輕關節腫脹和疼痛[18]；黃芪中的黃芪苷具有抗氧化作用，可以減輕氧化應激對關節的損傷[19]；麻黃中的麻黃堿可以促進關節的血液循環，加速關節的康復[20]。

研究[21]發現，烏頭湯與西藥聯用可有效改善關節炎活動期的臨床癥狀和相關生化指標，療效優于單用西藥，且副作用較小，安全性較高。Ⅱ型膠原在維持軟骨生物力學性能方面具有重要作用。軟骨細胞Ⅱ型膠原減少，會導致軟骨結構破壞，影響軟骨細胞生長微環境，進而使得軟骨細胞凋亡，因此Ⅱ型膠原的合成在RA的發生發展中具有重要作用[22-23]。本研究結果顯示，WTD+甲氨蝶呤組大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA表達水平高于WTD組、甲氨蝶呤組，體現了WTD與甲氨蝶呤聯用可在維持關節結構中發揮作用[24-25]。

p38MAPK信號通路在RA滑膜中可被強烈激活。研究[26-27]表明，阻斷或減少p38MAPK的表達會對軟骨起到保護作用。本研究結果顯示，WTD+甲氨蝶呤組p38MAPK mRNA、p38MAPK蛋白相對表達量均低于WTD組、甲氨蝶呤組，提示WTD+甲氨蝶呤可抑制p38MAPK信號通路，阻斷和減少p38MAPKA的表達，保護大鼠軟骨。WTD+甲氨蝶呤組大鼠血清TNF-α、IL-6水平低于WTD組、甲氨蝶呤組，說明WTD聯合甲氨蝶呤可有效減輕炎癥。RA的發病與細胞因子介導的炎癥反應具有重要聯系。如TNF-α、IL-6對軟骨細胞和滑膜細胞中的膠原酶和前列腺素E2活性具有刺激作用，還可進一步促進細胞產生更多炎癥因子，從而加重炎癥反應，促使滑膜增生[28-29]。炎癥小鼠全身TNF過度表達會導致關節組織中p38MAPK活化[30]。Pearson相關分析顯示，大鼠血清TNF-α、IL-6與p38MAPK mRNA相對表達量呈正相關，提示WTD和甲氨蝶呤可能是通過抑制p38MAPK mRNA的表達，抑制RA的炎癥發展。但本研究未考察WTD量效關系，以及其單獨對RA進行用藥是否與抑制p38MAPK信號通路有關，應進行深入研究分析。

綜上所述，WTD聯合甲氨蝶呤治療大鼠RA的效果佳，其作用機制可能與抑制p38MAPK信號通路有關。