常染色體隱性遺傳性羊毛狀發伴少毛癥兩家系基因突變分析

趙安琪 曹巧玉 鄭璐瑤 劉慶梅 李 明 吳文育 趙敬軍

1上海交通大學醫學院附屬新華醫院皮膚科,上海,200092;2上海交通大學醫學院皮膚病研究所,上海,200092;3復旦大學附屬兒科醫院皮膚科,上海,201102;4安徽省兒童醫院皮膚科,安徽合肥,230022;5復旦大學附屬華山醫院皮膚科,上海,200040

遺傳性少毛癥是一組相對罕見的遺傳性皮膚病,具有廣泛的基因譜和表型譜,根據是否伴隨其他系統損害分為綜合征型和非綜合征型。非綜合征型遺傳性少毛癥僅表現為毛發的異常,其毛發表型包括先天性少毛/無毛、羊毛狀發、念珠狀發等。目前已有文獻報道了兩種遺傳模式,分別是常染色體顯性遺傳和常染色體隱性遺傳[1]。在非綜合征型遺傳性少毛癥中,常染色體隱性遺傳性羊毛狀發伴少毛癥(autosomal recessive woolly hair/ hypotrichosis, ARWH/HT,OMIM 278150/604379)是一種發生于高加索人或亞洲人群中的遺傳性疾病。患者通常在出生時即表現出毛發的異常特征,其頭發呈粗糙、無光澤、干燥、卷曲,形成發干螺旋狀或波浪卷曲的外觀,導致頭發呈現彌漫性羊毛狀,并伴有不同程度的毛發稀疏。患者的毛發生長緩慢,到達一定長度后即停止生長,同時可能伴有毛發色素減退。眉毛、睫毛、胡須、腋毛和陰毛可能呈現稀少或正常狀態。其他方面,如牙齒、指(趾)甲及汗腺的發育正常,極少數患者可能伴有掌跖角化癥和毛周角化癥。目前已報道的致病基因包括:LIPH,LPAR6,C3ORF52,KRT25[2]。我們收集了兩例ARWH/HT家系,并進行了突變檢測以進一步了解該疾病的遺傳基礎。

1 病例資料

先證者1,男,24歲。出生后出現頭發卷曲、稀少,頭發生長緩慢,至2～3 cm后停止生長,易扯斷,眉毛、睫毛、腋毛、陰毛稀疏,牙齒、指甲、皮膚無明顯異常。父母非近親結婚,家族成員中無類似疾病患者。先證者2,女,7歲,表現為生后毛發卷曲、稀疏,頭發生長至3～4 cm后停止生長,發質粗糙,易纏繞打結,易折斷,牙齒、指甲、皮膚無明顯異常。父母非近親結婚,家族成員中無類似疾病患者。

體檢:兩例患者一般情況可,營養、智力、骨骼均發育正常,心、肺等系統檢查未見異常。皮膚科檢查:先證者1頭發稀疏明顯,可見頭皮裸露,頭頂部、后枕部可見頭發整體卷曲,發質粗糙,卷曲纏繞成團。眉毛、睫毛、腋毛和陰毛較稀疏(圖1a)。先證者2頭發卷曲呈羊毛狀改變,稍稀疏,眉毛、睫毛、腋毛和陰毛較稀疏,患者均無牙齒、黏膜、指甲等其他外胚層發育異常表現(圖1b)。綜合上述病史和體檢結果,診斷為羊毛狀發伴少毛。

2 基因突變檢測

2.1 外周血基因組DNA提取 經上海交通大學醫學院附屬新華醫院倫理委員會批準(批件號XHEC-D-2019-115),以及先證者1本人和先證者2的父母簽署知情同意書后,分別采取先證者及其父母外周血2 mL,應用QIAamp DNA Blood MinikitⅠ(德國QIAGEN公司)試劑盒提取全血基因組DNA。同樣方法提取100例無親緣關系的健康個體血樣基因組DNA作為對照。

2.2 二代靶向測序和Sanger測序 使用二代遺傳性皮膚病靶向測序包(上海安百隆生物科技有限公司)檢測先證者的突變基因,該測序包納入554個與遺傳性皮膚病密切相關的基因,靶向測序的范圍涵蓋目標基因外顯子及毗鄰剪接區域約20 bp。設計探針由遺傳性皮膚病權威專家設計,由瑞士羅氏NimbleGen合成。測序平臺選用IlluminaHiseq X Ten高通量測序儀測序,平均測序深度可達200×以上。在相關變異頻率數據庫[寡核苷酸多態性數據庫(dbSNP)、千人基因組數據庫、ClinVar數據庫和人類基因突變數據庫(HGMD)]中對致病變異位點進行評估,根據美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG)遺傳變異分類指南及患者的臨床表型進行致病變異的篩選。使用Primer-BLAST工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)設計基因引物,并通過PCR擴增,用ABI3730XL型全自動測序儀進行Sanger測序。E5正向引物5’-ATTAGCCTTGCAGTGGATGAGTG-3’,反向引物5’-CCTGCCAGGTATAAGCAGGAAT-3’,擴增片段長度為407 bp;E6正向引物5’-GGGTCTTTCACCAAAGCATA-3’,反向引物3’-GAGGAAACTGGTTAGAC-5’,擴增片段長度為434 bp;E7正向引物5’-GATTGGATCAACCTGGCTGC-3’,反向引物5’-ACATGCAGAATGGGCTCTCC-3’,擴增片段長度為306 bp;反應條件:96℃預變性3 min,96℃變性30 s,在相應Tm值溫度退火30 s,72℃延伸30 s,循環35次,73℃充分延伸5 min,4℃保存。

2.3 剪切突變驗證 對于先證者攜帶的剪切突變,我們進行了Minigene實驗的驗證。首先,將目的基因片段通過質粒轉染到293T細胞系中,進行細胞培養。隨后,采用Trizol法提取培養細胞中的RNA,并進行RT-PCR實驗,設計特定于突變位點的PCR引物,針對剪切突變c.982+12A>G設計引物序列為:LIPH-E7F:AGTGATGGTGAGTGTGGTTGTTGCTTTTGCCT-AA;LIPH-E7R:AACCACACTCACCACTCACTGCAGAATG。針對剪切突變c.629-1_629delinsTT設計引物序列為:LIPH-E5F:TATTACTGGGCTACAAGGAGCCAT ;LIPH-E5R:CTCCTTGTAGCCCAGTAATAAAAGAGAACACATCTGCT。對PCR產物進行凝膠電泳驗證后,我們回收產物并進行Sanger測序,以驗證其剪切方式。

3 結果

3.1 二代皮膚靶向測序包篩選和Sanger測序驗證結果 兩例先證者均檢測到了LIPH的復合雜合突變。先證者1的LIPH第6號外顯子第742位核苷酸由C突變為A(c.742C>A),導致第248位氨基酸由組氨酸變為天冬氨酸(p.His248Asn),同時第7號外顯子下游第12位核苷酸由A突變為G(c.982+12A>G),Sanger測序驗證顯示先證者父親為c.982+12A>G雜合突變攜帶者,先證者母親為c.742C>A雜合突變攜帶者。家系圖和突變攜帶情況見圖2a、2b。

2a、2b:家系1的先證者和父母突變信息;2c、2d:家系2的先證者和父母突變信息圖2 家系圖和先證者及父母的突變信息

先證者2的LIPH第5號外顯子上游第1位至編碼區第629位核苷酸由GC突變為TT(c.629-1_629delinsTT),同時第5號外顯子編碼區第687和688位核苷酸之間插入17 bp (c.686delinsGTAGAAC-CCAACCTGGCT),該插入突變會導致從229位天冬氨酸開始發生移碼突變,移碼37位氨基酸后編碼終止(p.Asp229GLyfs*37),Sanger測序驗證顯示先證者父親為c.686delinsGTAGAACCCAACCTGGCT雜合突變攜帶者,先證者母親為c.629-1_629delinsTT雜合突變攜帶者。家系圖和突變攜帶情況見圖2c、2d。100例對照中均未檢測到該四種突變。SIFT和Polyphen-2軟件預測p.His248Asn和p.Ile220Argfs*29均為有害變異位點,可能影響蛋白質功能。

3.2 剪切突變驗證結果LIPH剪切突變c.982+12A>G是指第7號外顯子下游第12位核苷酸由A突變為G,突變示意圖如圖3a中黃色標注所示。Minigene驗證發現該剪切突變會使剪切位點后延,導致7bp內含子序列滯留,圖3b展示了Sanger測序結果和錯誤剪切,內含子滯留部分標紅。

3a:LIPH c.982+12A>G剪切突變示意圖,如黃色標注所示;3b:Sanger測序結果,該剪切突變導致7 bp內含子序列滯留(標紅);3c:LIPH c.629-1_629delinsTT剪切突變示意圖;3d:Sanger測序結果,兩種錯誤剪切:①突變所在5號外顯子被跳過(主峰);②5號外顯子前AG缺失后,將內部AG識別為剪切信號,導致缺失14 bp(底峰)圖3 剪切突變驗證結果

LIPH剪切突變c.629-1_629delinsTT是指第5號外顯子上游第1位至編碼區第629位核苷酸由GC突變為TT,突變示意圖如圖3c中黃色標注所示。Minigene驗證發現該剪切突變會導致復雜剪切變異,同時存在兩種錯誤剪切:①突變所在5號外顯子被跳過(主峰);②5號外顯子前AG缺失后,將內部13-14位的AG堿基識別為剪切信號,導致缺失14 bp(底峰);這兩種錯誤剪切如圖3d所示。

4 討論

常染色體隱性羊毛狀發/少毛癥(ARWH)是一種罕見的遺傳性毛發疾病,臨床特征為出生時或生后早期出現頭發卷曲稀疏。目前已報道的基因包括LIPH,LPAR6,KRT25和C3ORF52等[2]。LIPH基因定位于人染色體3q27上,含有10個外顯子,編碼451個氨基酸,它編碼脂肪酶H,也稱為膜相關性磷脂酸-選擇性磷脂酶A1α,主要功能是催化水解磷脂酸產生2-酰基溶血磷脂酸(2-acyl lysophosphatidic acid, LPA)。C3ORF52能與LIPH相互作用,影響其催化功能[3]。LPA會激活溶血磷脂酸受體6(lysophosphatidic acid receptor 6,LPAR6),LIPH、LPAR6或C3ORF52的功能喪失會導致LIPH- LPA -LPAR6信號傳導減少,導致表皮生長因子受體信號傳導的反激活減少,從而影響毛囊發育和毛發生長[2]。目前已報道的LIPH基因致病突變位點有34個,包括12個錯義/無義突變,4個剪接突變,7個缺失突變,4個插入突變,以及4個缺失-插入突變(www.hgmd.cf.ac.uk)。

ARWH具有遺傳異質性,因種族和國家/地理區域而異。在巴基斯坦ARWH人群中,47.2%由LIPH突變導致,其余52.8% ARWH患者由LPAR6突變導致。在巴基斯坦LIPH突變患者中,超過一半攜帶c.659_660delTA (p.Ile220Argfs*29)突變。在日本ARWH人群中,98.7%攜帶LIPH突變,且熱點突變為c.736T>A (p.Cys246Ser)和c.742C>A (p.His248Asn)[2]。在我國尚未有統計LIPH突變占比和熱點突變情況。據我們統計,目前中國已經報道的LIPH突變患者中,c.736T>A和c.742C>A突變占75%左右[4-12]。

目前,已有日本的兩項研究發現,外用米諾地爾可以改善LIPH突變導致的ARWH患者。在其中一項前瞻性非隨機臨床試驗中,共納入8例攜帶LIPH致病突變的ARWH患者和1例TRPS1致病突變導致的毛發-鼻-指綜合征患者,所有納入者均每天2次外用1%米諾地爾,持續一年,發現所有具有LIPH致病變異的患者少毛癥狀均有改善,毛發-鼻-指綜合征患者的少毛癥沒有改善[13]。在另一項研究中,共納入4例具有LIPH突變的日本ARWH患者,所有患者在局部應用米諾地爾后均出現毛發生長[14]。

我們團隊在2020年報道一例羊毛狀發患者攜帶LIPHc.686delAinsGTAGAACCCAACCTGGCT突變,該突變與先證者2的突變位點一致,導致D229Gfs*37的移碼突變,最終產生截斷蛋白[6]。此外,本報道中發現了兩個新的LIPH剪切突變c.982+12A>G和c.629-1_629delinsTT。剪切突變是指影響基因剪切過程的一類突變,可能引起多種轉錄本的變化,包括外顯子跳躍、內含子保留、部分外顯子缺失以及復雜剪切變異(包括外顯子跳躍、內含子保留等多種組合)等。而這些異常剪切的結果是蛋白質缺失一長段氨基酸或者更為常見的翻譯提前終止(插入、缺失的序列往往不是3的倍數)。我們通過Minigene實驗驗證發現該剪切突變導致的錯誤剪切。其中,c.982+12A>G導致出現7 bp的內含子滯留,c.629-1_629delinsTT則同時導致了5號外顯子跳躍和部分5號外顯子缺失。我們的研究進一步豐富了LIPH的基因譜,具體機制有待進一步功能學實驗證明。