三種特應性疾病與斑禿發生風險的因果關系:兩樣本孟德爾隨機化研究

徐媛媛 郭玲宏 吳姝瑋 張 婷 張 璐 蔣 獻

1四川大學華西醫院皮膚性病科,四川成都,610041;2四川大學疾病分子網絡前沿科學中心免疫炎癥研究院皮膚病學研究室,四川成都,610041

斑禿(alopecia areata, AA)是一種普遍出現的炎癥性非瘢痕性脫發疾病,其典型臨床特征為頭皮或/和身體其他部位呈現斑片狀的毛發脫失,嚴重病例可能發展至全頭皮甚至全身毛發的完全脫落[1]。作為一種自身免疫性疾病,斑禿的發病機制尚未明確,可能與毛囊的“免疫特權”被破壞,免疫系統錯誤地識別并攻擊自體毛囊,從而引發一系列炎癥反應和毛囊損傷有關[2,3]。斑禿的發生能夠對患者的健康相關生活質量造成重大的負面影響,尤其是對患者的心理健康產生顯著的損害,使患者面臨更高的抑郁、焦慮、社交恐懼及人格障礙風險[4,5]。 目前,斑禿的治療仍然面臨顯著挑戰,至今尚未有被公認能夠完全治愈該病癥的療法。常見的治療策略主要基于對免疫反應的抑制或刺激,包括局部或系統性的皮質類固醇激素、接觸免疫治療、免疫調節劑、米諾地爾以及光療等手段,其主要目的在于控制疾病的發展,刺激和促進毛發再生,但療效通常有限[6-8]。

特應性疾病(atopic conditions),如哮喘、特應性皮炎以及過敏性鼻炎等,是一組由遺傳因素和環境過敏原共同作用引發的免疫學相關疾病[9]。患有特應性疾病的個體通常具有特應性遺傳易感性,當暴露于環境中的過敏原時,出現異常的免疫反應[10]。相對普通人群而言,特應性疾病患者更容易發展為斑禿;該現象在多項流行病學研究中得到證實,提示著特應性疾病與斑禿發病風險增加之間可能存在關聯性[1,11,12]。然而,由于觀察性流行病學本身性質所具有的限制,它們的結論容易受到環境因素或者統計過程中偏移的影響,且并不能揭示特應性疾病與斑禿發生風險之間是否存在因果關系。因此,特應性疾病是否是斑禿發生的危險因素仍然存在爭議。

孟德爾隨機化是一種利用基因變異作為工具變量,以推斷暴露和結局之間的因果關系的研究[13]。 孟德爾隨機化利用遺傳變異的隨機分布,規避了傳統的觀察性研究中來自混雜因素和反向因果關系的影響,使得其探究的關聯結果更加準確可靠[14]。 目前,還沒有研究應用孟德爾隨機化來探究特應性疾病與斑禿發生風險之間的因果關系。因此,本研究旨在通過一項雙樣本孟德爾隨機化研究,評估三種特應性疾病(哮喘、特應性皮炎以及過敏性鼻炎)與斑禿發生之間的潛在因果關系,以期為特應性疾病與斑禿兩類疾病之間的關聯性提供來自遺傳學的證據。

1 對象和方法

1.1 研究設計 本研究使用全基因組關聯研究 (genime-wide association study, GWAS)的匯總數據集進行兩樣本孟德爾隨機化分析,探討特應性疾病(包括哮喘、特應性皮炎以及過敏性鼻炎)對斑禿發生風險的潛在因果效應,并通過一系列后續敏感性分析檢驗該因果關聯的可靠性。具體而言,分別將哮喘、特應性皮炎以及過敏性鼻炎被設定為暴露因素,將斑禿被設定為結局因素,而與哮喘、特應性皮炎和過敏性鼻炎顯著相關的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)則被應用為工具變量。

本研究所進行的兩樣本孟德爾隨機化分析是基于三個假設,包括:(1)每次分析應用的工具變量分別與三種暴露因素(哮喘、特應性皮炎以及過敏性鼻炎)存在強烈的關聯性;(2)工具變量與同暴露因素或者結局因素相關的任何其他混雜因素無關;(3)工具變量僅通過與暴露因素的關聯影響結局因素。

1.2 數據來源與工具變量的選擇 斑禿的匯總數據集來源于FinnGen Biobank (https://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_L12_ALOPECAREATA.gz),包含682例患者和361140名對照[15]。哮喘的相關數據來源是OpenGWAS數據庫(ID: ebi-a-GCST90014325);該數據集包括56167例患者和352255名對照個體。特應性皮炎的匯總數據集來源于GWAS catalog數據庫(ID: GCST900244787),包括60653例患者和804329名對照[16]。最后,過敏性鼻炎的遺傳數據也來源于GWAS catalog數據庫(GCST90086042),包括13936例患者和42701名對照[17]。暴露和結局的所有遺傳數據未發現重疊現象,且均來自于歐洲血統的個體,以避免由于種族差異造成的偏移。由于所有的遺傳數據均來源于公共數據庫或者可以公開獲取的文章,本研究并不涉及倫理批準或者患者知情同意。

為了確保SNP與各暴露因素強相關,將該關聯性閾值設置為p-value< 5×10-8;為了避免連鎖不平衡的干擾,將參數r2閾值設置為r2<0.001,遺傳距離閾值設置為10000千堿基對(kilobase pairs, kb);為了避免弱工具變量可能造成的偏移,將F統計量的閾值設置為F>10。

1.3 統計學方法 本研究使用R語言(4.2.3版本)中的“TwoSampleMR”包進行所有的統計學分析。該兩樣本孟德爾隨機化采用逆方差加權法(inverse-variance weighted, IVW)作為主要的分析方法,若存在明顯異質性則采用隨機效應模型,若無明顯異質性則采用固定效應模型;也進一步采用MR-Egger回歸、加權中位數、簡單模型和加權模型4種方法進行補充分析,以驗證逆方差加權法分析的可靠性。

除上述孟德爾隨機化分析方法外,我們也進行了一系列額外分析,如使用Cochran Q檢驗以驗證SNP間是否存在顯著異質性、MR-Egger截距檢驗以驗證所有結果中是否存在顯著水平多效性、留一法(Leave-one-out analysis)檢測暴露與結局之間的關聯性是否主要受單個SNP的驅動和影響。本研究使用優勢比(odds ratio,OR)及其95%置信區間(95%CI)以量化評估特應性疾病與斑禿之間的潛在因果關系。所有的統計檢驗均采用雙尾檢驗,P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 工具變量的篩選與確定 分別篩選與三種暴露因素顯著相關的SNPs(P<5×10-8),并去除連鎖不平衡的SNPs,最終篩選得到64個、61個以及3個SNPs,分別作為研究哮喘、特應性皮炎以及過敏性鼻炎與斑禿發病風險之間因果關系的工具變量。根據計算,三項關聯研究中分別使用的工具變量F值均大于10,表明存在弱工具變量的風險較小。

2.2 特應性疾病對斑禿發病風險的影響 如表1及圖1所示,依據IVW法的分析結果,基因預測的哮喘與斑禿發病風險增加相關(OR:1.45;95%CI:1.67～1.97),且哮喘與斑禿發病風險增加之間的關聯性具有顯著的統計學意義(P=0.017)。同樣,IVW法分析表明基因預測的特應性皮炎與斑禿發病風險增加相關(OR:1.79;95%CI:1.28～2.51),且這種關聯性具有顯著的統計學意義(P=6.762×10-4)。哮喘與斑禿發病風險增加之間的關聯性進一步被MR-Egger回歸、加權中位數、簡單模型和加權模型證實;而特應性皮炎與斑禿發病風險增加之間的關聯性進一步被加權中位數和加權模型支持。此外,依據IVW法的分析結果,基因預測的過敏性鼻炎與斑禿發病風險之間雖然也呈現出正相關的趨勢,但這種關聯性并未達到顯著的統計學意義(OR:1.88;95%CI:0.89～3.96;P=0.096)。

圖1 三種特應性疾病與斑禿孟德爾隨機化分析的散點圖

表1 五種方法對三種特應性疾病與斑禿孟德爾隨機化分析的結果

2.3 敏感性分析 此外,我們還分別對三種關聯關系進行了一系列的敏感性分析,包括異質性檢驗、水平多效性檢驗、留一法分析、漏斗圖等,以驗證暴露因素和結局之間關聯性的可靠性。SNP間的異質性通過Cochran Q檢驗進行驗證,結果顯示與哮喘密切相關的64個SNP間、與特應性皮炎密切相關的61個SNP間存在異質性(P=0.001;P=5.316×10-5),而和過敏性鼻炎(P=0.612)密切相關的SNP間均未發現顯著異質性。依據異質性的存在與否,在使用IVW方法時選擇相對應的模型進行分析。暴露因素與結局因素之間關聯性是否存在水平多效性通過MR Egger截距檢驗進行驗證,在哮喘與斑禿(P=0.158)、特應性皮炎與斑禿(P=0.888)、過敏性鼻炎與斑禿(P=0.503)三種關聯性中均未發現顯著的水平多效性存在。留一法的分析結果如圖2所示。結果顯示,三種特應性疾病與斑禿發病風險之間的關聯性均未受到單一的SNP影響或者驅動,進一步驗證了結果的可靠性和一致性。最后,漏斗圖顯示當以逐個SNP為工具變量時,哮喘和斑禿、特應性皮炎與斑禿之間的因果關聯效應的散點基本對稱分布于IVW法分析結果的兩側,表明不存在潛在的偏倚(圖3)。

圖2 三種特應性疾病與斑禿“留一法”分析的結果圖

圖3 孟德爾隨機化分析漏斗圖

3 討論

本文基于孟德爾隨機化的方法,從基因層面探究了三種特應性疾病(哮喘、特應性皮炎和過敏性鼻炎)分別與斑禿發病風險之間的因果關系。本研究結果表明,基因預測的哮喘、特應性皮炎分別與斑禿發病風險之間存在顯著正向的關聯性,而過敏性鼻炎與斑禿發病風險之間則無顯著關聯性。本研究結果提示,在特應性疾病患者中,特別是針對哮喘患者以及特應性皮炎患者,需要警惕斑禿發病風險增高的可能性。

此前,已有很多觀察性研究證明了特應性疾病與斑禿在流行病學上存在顯著的關聯性[11,12,18-20]。根據最近兩項基于大型人群隊列的研究結果顯示[18,20],斑禿人群中特應性皮炎、哮喘和過敏性鼻炎等特應性疾病的患病率顯著升高;且三種特應性疾病與斑禿之間均存在顯著關聯性。然而,由于這些回顧性研究設計的限制,它們并無法揭示特應性疾病與斑禿之間的時間相關性,因此無法驗證特應性疾病與斑禿之間的因果關系[20]。 本項孟德爾隨機化從基因層面進一步驗證了過往回顧性研究結論的可靠性和一致性。雖然我們的研究僅得出哮喘或特應性皮炎與斑禿之間的顯著關聯性,過敏性鼻炎與斑禿之間的呈正向相關、但未達到顯著統計學水平;但這可能是由于目前針對過敏性鼻炎能夠公開獲取的GWAS統計數據較為有限,相關GWAS研究所涉及的患者及對照組樣本較小,因此所能作為工具變量使用的SNP數量較少,未能得到陽性結果。未來期待更多針對不同種族、更大樣本數量的過敏性鼻炎患者的基因測序數據,以證實過敏性鼻炎與斑禿發病風險之間的因果關聯。

盡管臨床上將特應性疾病史視為斑禿的獨立危險因素,然而特應性疾病增加斑禿發病風險的具體機制目前并不清楚[12,21]。過往研究和觀點通常聚焦于斑禿病理過程中涉及的TH1/IFN-γ炎癥反應,但近期研究表明TH2信號通路在斑禿發病中同樣關鍵。TH2軸的關鍵細胞因子IL-4、IL-13與斑禿發病密切相關,一項針對斑禿患者和正常對照的GWAS研究證實IL-13是斑禿的易感基因位點[22];一項針對土耳其人群的基因分析研究顯示,IL-4基因內含子多態性與斑禿的易感性相關[23]。此外,斑禿患者血漿以及頭皮皮損部位均發現明顯的TH2相關細胞因子的上升[24-27]。 部分病例報道以及2期臨床試驗證實了度普利尤單抗,一類抑制TH2信號通路的單克隆抗體,能夠使得斑禿患者頭發再生長;這進一步表明了TH2軸在斑禿發病中的潛在致病作用以及靶向TH2在治療斑禿中的應用潛力[28-31]。 而TH2上調一直被認為是特應性疾病,特別是哮喘、特應性皮炎和過敏性鼻炎的重要特征,多項大型臨床試驗中應用靶向TH2的生物制劑治療特應性疾病的有效性也進一步證實了TH2通路在這類疾病中的異常變化[32-34]。 此外,新型小分子靶向藥物正處于皮膚病臨床試驗的最前沿;其中,口服酪氨酸蛋白激酶(JAK)抑制劑,如巴瑞替尼和托法替尼,均在斑禿和特應性皮炎的臨床治療中展現出良好的療效和潛力[35]。目前已明確與斑禿發病密切相關的細胞因子如IFN-γ、IL-2等,以及與特應性皮炎密切相關的細胞因子如IL-4、IL-13、IFN-γ等,可通過刺激JAK/ STAT信號通路實現炎癥反應的信號轉導[36]。由此可見,特應性疾病與斑禿兩類疾病之間可能共享相似的發病通路和遺傳學背景。這可能是基因預測的特應性疾病增加斑禿發病風險的根本原因,而其中涉及的具體分子需要更多基礎研究進行解釋和支撐。

我們的研究存在限制。首先,在孟德爾隨機化分析中完全排除多效性,即滿足基本假設2是具有挑戰性的,因為識別所有可影響暴露和結果的混雜因素是非常困難的。在孟德爾隨機化分析之后,我們進行了MR- Egger截距檢驗以驗證本項孟德爾隨機化中不存在顯著的水平多效性。其次,特應性疾病和斑禿的GWAS數據集均來自歐洲血統人群,以避免由于種族相關混雜因素造成的偏差,但是限制了我們推斷不同人群結論的能力,因此需要對其他族群進行進一步的研究來驗證我們的結論。最后,由于GWAS數據集中缺乏更多信息,本研究沒有進行基于不同特征,如年齡、性別或疾病嚴重程度的分層分析。

綜上所述,本項孟德爾隨機化研究為基因預測的兩種特應性疾病(哮喘、特應性皮炎)與斑禿發病風險之間的關聯性提供了來自遺傳學角度的相關證據。我們期待未來會有更完整與全面的相關GWAS匯總數據集,以進一步為過敏性鼻炎與斑禿發病風險之間的關聯性提供證據支持。