老年慢性心力衰竭病人血清微RNA-21、白細胞介素-6、腦利鈉肽水平與預后的關系研究

侯杰，王麗芳，李園春，劉勇，姚海濤

作者單位：1唐山中心醫院急診科，河北 唐山063008；2唐山市豐南區醫院內科，河北 唐山063300；3鹽山縣人民醫院內三科，河北 滄州061300

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指病人由于心肌梗死、炎癥或血流動力學負荷過重等各種原因導致心肌細胞損傷，功能喪失，心肌收縮/舒張力減弱，心臟的搏出量不能滿足機體代謝需要而引起的一系列臨床綜合征，是各種心臟疾病的終末期［1-2］。臨床表現為全身乏力、呼吸困難及體液潴留等。CHF病人病情復雜，危險性高，預后差。所以盡早對病人的預后作出評價，對預后不良的病人可實現干預措施前移，避免或延緩心血管事件的發生。美國心臟病學會/美國心臟協會（ACC／AHA）心衰指南根據CHF的嚴重程度分為四個階段，但這四個階段的劃分對預后的預測價值不高。目前臨床雖有一些與CHF有關指標對預后的評估有一定的作用，但至今為止仍未形成共識。因此尋找新的、有價值的標志物對CHF的診治有積極的意義。隨著研究的深入，臨床已公認CHF是一種多層次、多系統功能改變，或多分子、基因功能衰竭交互作用的結果，這些交互作用變化包括胚胎蛋白和基因的再表達，心肌細胞肥大、凋亡等變化。近年來的研究已證實心室重構的發生與進展與過度表達的活性分子有關，其中細胞因子平衡失調及神經內分泌系統紊亂在心室重構的進程中起著重要作用［3］。同時心室重構是一個“進展性”過程，心肌細胞在多種病因的作用下功能形態會逐漸趨于異常，直至CHF癥狀出現并進展至終點事件-死亡，這是一個持續進展的過程。腦利鈉肽（BNP）是Sudoh在上世紀八十年代從豬腦中發現的由心室合成的一種循環激素，現有的研究已證明心室容量或壓力負荷增加時，BNP水平會隨之升高［4］，說明BNP參與了CHF的發生和進展。但單一指標靈敏度和特異度較低。近年來研究發現，血清微RNA-21（miRNA-21）在急性心肌梗死病人中的表達異常升高［5］。白細胞介素-6（IL-6）可通過各種機制引起心功能不全。目前國內外相關文獻對于BNP、IL-6與CHF危險分層及預后關系的研究較多，但miRNA-21與CHF預后關系的研究研究較少，尚無血清miRNA-21、IL-6、BNP與CHF預后關系的研究。本研究根據是否發生CHF再次入院和全因死亡分組，比較兩組血清miRNA-21、IL-6、BNP水平，并分析水平變化與預后的關系，為臨床提供理論依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為唐山中心醫院2020年1月至2021年1月住院的老年CHF病人，選擇其中符合以下入排標準的120例病人為本研究樣本。研究樣本均隨訪至2022年1月31日，以發生CHF再入院、全因死亡為終點事件，發生終點事件的46例病人為預后不良組，年齡范圍60～79歲；未發生終點事件的74例病人為預后良好組，年齡范圍60～78歲；兩組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。本研究方法均告知病人或近親屬，其知情同意并簽署知情同意書，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

表1 兩組老年慢性心力衰竭（CHF）病人一般資料比較

1.2 納入及排除標準 納入標準：①符合中華醫學會心血管病學分會《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》中CHF診斷標準，年齡≥60周歲；②CHF病史≥6個月。

排除標準：①合并腎功能并不全者、甲狀腺疾病及免疫性疾病者；②合并惡性腫瘤者；③急性心肌梗死及呼吸衰竭病人；④入院前1周使用過激素、免疫抑制劑等影響檢測指標藥物者。

1.3 方法

1.3.1 實驗室相關指標檢測 采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測IL-6、BNP水平；miRNA-21采用實時熒光定量技術，先用Trizo1法對總RNA進行抽提和純化，純度符合要求后按以下步驟操作：①以cDNA為模板行熒光定量PCR，采用大連寶生物TaKaRa公司的熒光定量PCR試劑盒；②以總RNA為模板行逆轉錄反應；③PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測；④采用相對定量方法，以miR39為外參基因，計算3次，取平均值作為血清miRNA-21值。

1.3.2 超聲檢測 所有病人均于入院24 h內行心臟超聲檢查，檢測左室射血分數（LVEF）、左心室舒張末期內徑（LVEDD）。

1.4 統計學方法 使用EXCEL 2016進行數據匯總，使用SPSS 23.0進行研究資料分析。研究資料中的計量數據，均通過正態性檢驗，以描述，兩組間的比較為成組t檢驗或校正t'檢驗。計數資料以例（%）描述，兩組比較為χ2檢驗或校正χ2檢驗。此外，影響因素分析及多指標聯合應用之預測評估模型的建立采用多因素非條件logistic回歸。預測診斷評估效能分析為受試者操作特征（ROC）曲線分析。統計檢驗水準α=0.05，均為雙側檢驗。

2 結果

2.1 兩組心功能比較 預后良好組與預后不良組心功能分級差異有統計學意義（P＜0.05）。預后良好組LVEF高于預后不良組，LVEDD低于預后不良組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組老年慢性心力衰竭（CHF）病人心功能分級及LVEF、LVEDD比較

2.2 兩組血清miRNA-21、IL-6、BNP水平比較預后良好組血清miRNA-21、IL-6、BNP水平均低于預后不良好組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 老年CHF病人預后良好組與預后不良組病人血清miRNA-21、IL-6、BNP水平比較/

表3 老年CHF病人預后良好組與預后不良組病人血清miRNA-21、IL-6、BNP水平比較/

注：CHF為慢性心力衰竭，miRNA-21為血清微RNA-21，IL-6為白細胞介素-6，BNP為腦利鈉肽。

BNP/（ng/L）524.99±39.82 1 963.58±85.73 106.87＜0.001組別預后良好組預后不良好組t值P值例數74 46 miRNA-21 0.52±0.08 1.19±0.13 31.45＜0.001 IL-6/（μg/L）71.46±10.57 139.75±19.76 21.60＜0.001

2.3 CHF病人預后不良的影響因素分析 為探討CHF病人預后不良的影響因素，建立非條件logistic回歸模型。以本研究資料為樣本，以CHF病人預后為應變量，賦值預后不良（發生CHF再入院或全因死亡）=1，預后良好=0。以心功能指標及血清miRNA-21、IL-6、BNP水平作為自變量。其中，心功能3個指標互有較強的共線相關關系，經臨床和統計人員會商，只選擇LVEF指標。回歸過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05。

回歸結果：心功能（LVEF）指標及三個血清指標（miRNA-21、IL-6、BNP）均被保留入回歸模型，P＜0.05，OR＞1，即它們均是CHF病人預后不良的危險因素。見表4。

表4 心功能LVEF及血清miRNA-21、IL-6、BNP水平對老年慢性心力衰竭（CHF）預后影響的logistic回歸結果

2.4 血清miRNA-21、IL-6、BNP水平對CHF預后的預測評估效能分析 進一步探討血清miRNA-21、IL-6、BNP等三指標對CHF預后的預測評估效能：以預后不良組為陽性樣本（n=46），以預后良好組為陰性樣本（n=74），建立ROC預測分析模型。

單獨應用：各指標均參考臨床實踐劃分成若干個組段，再以軟件擬合之ROC曲線讀取約登指數最大值點，對應計算理論閾值和各項參數。并按實測樣本計算敏感度、特異度、準確度。

聯合應用（LogP模式）：以前述logistic回歸結果，建立血清miRNA-21、IL-6、BNP等三指標聯合應用的預后風險評估/預測模型，以其Log（P/1-P）=1.020×miRNA-21+0.048×IL-6+0.016×BNP為聯合應用的虛擬概率量指標，再行ROC分析。

分析結果顯示：聯合應用診斷效能很高，AUC及靈敏度、特異度、準確度均較各單獨應用指標有明顯提升。見表5。

表5 血清miRNA-21、IL-6、BNP對老年慢性心力衰竭（CHF）病人預后的預測價值

3 討論

3.1 血清BNP水平與預后的關系 大量的研究已證實機體神經內分泌系統在心功能出現異常之初就已被激活，并參與心肌重構［6］。同時神經內分泌系統激活后，隨著時間的延長，并在血流動力學等因素的相互影響下加速心功能的進一步惡化，心室的適應性逐漸降低，最終進展為有癥狀的CHF。而作為心血管神經內分泌系統標志物之一的心臟肽類物質首先引起了臨床的高度關注。研究發現，當心室容量或壓力負荷升高時，BNP水平會隨之高，其主要作用是拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統［7］。大量研究已證實，CHF病人BNP水平高于健康人群，且CHF病人病情越嚴重，BNP水平越高［8］。Maisel等［9］分析了LVEF與BNP水平的相關性，結果顯示，LVEF與BNP水平呈顯著負相關（r=-0.46，P＜0.05）。本研究結果顯示，預后良好組血清BNP水平低于預后不良好組，差異有統計學意義（P＜0.05）。且預后良好組LVEF高于預后不良組，LVEDD低于預后不良組，差異有統計學意義（P＜0.05），與Maisel等研究結果基本相符。提示隨著BNP水平升高，CHF病人心功能狀態越差。而進一步的logistic回歸分析顯示，CHF病人較高的BNP水平是預后不良的危險因素，故BNP指標對病人預后的評估及治療有一定的指導價值。

3.2 血清IL-6水平與預后的關系 細胞因子是由免疫和非免疫細胞分泌合成的小分子多肽，作用是調節細胞生理功能。IL-6是調節炎性和免疫反應的多功能細胞因子，單核細胞、血管內皮細胞、吞噬細胞及T2淋巴細胞等激活后均可產生IL-6。近年來有研究發現，CHF病人的死亡還與促炎細胞因子水平升高有關［10］。另有研究［11］顯示，高IL-6水平的CHF病人病死率高于低IL-6水平的病人，差異有統計學意義。認為IL-6可結合心肌成纖維細胞與心肌細胞上的受體，增加一氧化氮（NO）的合成，誘導心臟纖維化和肥大致舒張功能障礙。另有動物實驗研究［12］顯示，IL-6通過Janus激酶-信號轉導和轉錄激活因子（STAT3）途徑抑制左室乳頭肌收縮功能，認為IL-6介導的負性肌力作用是通過促進心肌合成N0而實現的，隨著心功能不全的加重，血清IL-6水平呈進行性增高。因此，檢測血清IL-6水平可間接反映CHF病人的血流動力學紊亂，并可作為預后預測的獨立指標。本研究結果顯示，預后良好組血清IL-6水平低于預后不良好組，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步logistic回歸分析顯示：較高水平的IL-6，也是CHF病人預后不良的危險因素。故血清IL-6有一定的預測CHF病人預后的評估效能，此點亦為本研究的ROC分析結果所證實。

3.3 血清miRNA-21水平與預后的關系 MicroRNA（miRNA）是一類內生的微小RNA，早期的臨床研究發現，miRNA-21在多個器官惡性腫瘤中呈高表達，因此一直將其視為致癌性物質。近年來miRNA-21在心血管疾病上的作用受到臨床的普遍關注［13］。有文獻報道［14］，miRNA幾乎參與了包括心肌缺血、冠狀動脈狹窄、心肌肥厚、CHF等所有心血管疾病的病理過程，而miRNA-21在其中參與了多個細胞信號轉導通路的調控。近年來研究發現，miRNA-21可外周血中可穩定存在，并在急性心肌梗死病人中的表達異常升高［14-15］，提示其可能成為心血管疾病病人的又一敏感指標。本研究結果顯示，預后良好組血清miRNA-21水平低于預后不良好組，差異有統計學意義（P＜0.05）。logistic回歸分析顯示，較高水平的miRNA-21，是CHF病人預后不良的危險因素。基于此建立的ROC曲線，證實血清miRNA-21預測CHF病人預后的AUC在單一指標中預測價值最高。究其原因可能是當心臟負荷增加時，會上調miRNA-21表達，并激活纖維化基因程序，促進心肌細胞纖維化［16-18］。

最后，本研究結果顯示，血清miRNA-21、IL-6、BNP聯合預測CHF病人預后的AUC 95%CI為0.86（0.77，0.94），Youden為0.69，均遠高于3種指標的單獨應用。此結果提示該聯合應用方法，能有效地用于CHF的早期診斷和預后評估，為CHF病人的靶向治療提供新思路。當然，本研究由于樣本量較少，研究結果可能存在偏差，后期將擴大樣本，對研究結果進一步證實。