KRT23激活A(yù)KT信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖

梁杏花?劉佛球?顏蓉?胡娟

【摘要】目的 探討角蛋白23（KRT23）高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖對肝癌的影響。方法 通過生物信息學(xué)分析KRT23在肝癌中的表達(dá)，過表達(dá)及抑制KRT23后采用噻唑蘭（MTT）、克隆形成實驗分析KRT23對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。通過軟件預(yù)測，實時熒光定量PCR（qPCR）及蛋白免疫印跡法實驗分析KRT23與AKT 信號通路的調(diào)節(jié)關(guān)系。結(jié)果 肝癌中KRT23的表達(dá)水平明顯高于正常對照組織。MTT、克隆形成實驗顯示KRT23過表達(dá)后促進(jìn)細(xì)胞增殖，而下調(diào)KRT23后抑制細(xì)胞增殖；通過基因富集分析（GSEA）， qPCR及蛋白免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)KRT23可激活A(yù)KT信號通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時在過表達(dá)KRT23細(xì)胞中抑制AKT信號通路后細(xì)胞增殖能力明顯下調(diào)。結(jié)論 KRT23調(diào)控AKT信號通路影響肝癌細(xì)胞增殖，提示KRT23在肝癌的惡性進(jìn)程中具有重要的作用，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色。

【關(guān)鍵詞】KRT23；AKT信號通路；肝癌；增殖

KRT23 promotes the proliferation of liver cancer by activating AKT signaling pathway Liang Xinghua， Liu Foqiu， Yan Rong， Hu Juan. Department of Gastroenterology， the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 511300， China

Corresponding author， Liang Xinhua， E-mail： 122002858@qq.com

【Abstract】Objective To investigate the effect of high keratin 23 （KRT23） expression promoting cell proliferation on liver cancer. Methods The expression of KRT23 in liver cancer was analyzed by bioinformatics. After overexpression and inhibition of KRT23， the effect of KRT23 on the proliferation of liver cancer cells was analyzed by MTT and clone formation assay. The regulatory relationship between KRT23 and AKT signaling pathway was analyzed by software prediction， qPCRand Western blot. Results The expression level of KRT23 in liver cancer was significantly higher than that in normal control tissues. MTT and clone formation assay showed that overexpression of KRT23 promoted cell proliferation， while downregulation of KRT23 inhibited cell proliferation. GSEA analysis， qPCR and Western blot showed that KRT23 could activate the AKT signaling pathway and promote cell proliferation. Meanwhile， inhibition of AKT signaling pathway in overexpressing KRT23 cells significantly reduced cell proliferation. Conclusions KRT23 affects the proliferation of liver cancer cells by regulating the AKT signaling pathway. These results suggest that KRT23 exerts significant effects upon the malignant procession of liver cancer and may play an important role in the occurrence and development of liver cancer.

【Key words】KRT23；AKT signaling pathway；Liver cancer；Proliferation

肝細(xì)胞癌（肝癌，HCC）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤。肝癌的發(fā)病率在各類腫瘤中排名第五，是世界上第六大常見病和第三大癌癥相關(guān)死亡原因［1-2］。肝癌病死率之高主要由于其復(fù)發(fā)率較高，據(jù)報道肝癌兩年復(fù)發(fā)率為50%，而這種高復(fù)發(fā)率主要是由于腫瘤的增殖能力和耐藥性導(dǎo)致［3］。因此，迫切需要了解影響肝癌進(jìn)展和惡性增殖的潛在機(jī)制。從數(shù)千個基因中區(qū)分促進(jìn)肝癌惡性進(jìn)程的關(guān)鍵基因?qū)τ谝种七@一過程是必不可少的，但仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。角蛋白分為Ⅰ型角蛋白（含 KRT9～KRT20）和Ⅱ型角蛋白（含KRT1～KRT8），可作為影響上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的中間絲蛋白［4］。據(jù)報道角蛋白23 （KRT23）與肝臟疾病密切相關(guān)［5］。KRT23是過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）的靶基因，被MYC擴(kuò)增，可能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖并導(dǎo)致肝癌［6］。然而，KRT23在肝癌中對腫瘤進(jìn)程的影響及具體機(jī)制尚不清楚。本研究旨在觀察KRT23在肝癌中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖功能的影響，探討其能否作為肝癌預(yù)防及治療靶點。

材料與方法

一、主要材料

HCCLM3細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心；培養(yǎng)基相關(guān)試劑購自美國Hyclone公司；Lipo3000? Transfection Reagent試劑購自碧云天；雙熒光素酶實驗試劑盒由美國Promega公司生產(chǎn)；GAPDH抗體、KRT23抗體均由博士德公司生產(chǎn)；LY294002購買于Sigma公司；實時熒光定量PCR （qPCR）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均由Takala公司生產(chǎn)。KRT23過表達(dá)pcDNA3.1質(zhì)粒（KRT23）及空載pcDNA3.1質(zhì)粒，干擾質(zhì)粒及引物，均由廣州艾基生物技術(shù)有限公司設(shè)計并構(gòu)建；PCR儀器為美國R&D公司生產(chǎn)；BX43顯微鏡為日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。肝癌組織樣本收集于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科，并獲得倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：2023-D-006）。

二、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

HCCLM3細(xì)胞用含10% FBS的1640 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并加入鏈霉素和青霉素預(yù)防污染。觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞融合長至70%～80%時進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染等實驗。

2.細(xì)胞處理

將HCCLM3細(xì)胞接種于6孔板，使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞分組如下，過表達(dá)KRT23組（HCCLM3-KRT23）及其過表達(dá)對照組（HCCLM3-vector）、干擾KRT23組（HCCLM3-KRT23/RNAi）及其干擾對照組（HCCLM3-RNAi-vector）。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，換為1640培養(yǎng)基（10% FBS）繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

3. 噻唑蘭（MTT）檢測細(xì)胞活力

收集對數(shù)期細(xì)胞，將細(xì)胞種植于96孔板，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至2×103個細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h后向待測孔中加入5 mg/mL MTT溶液，每孔20 μL；4 h后加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上振蕩10 min，

使結(jié)晶物充分溶解；酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光度值。

4.克隆形成實驗

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度500細(xì)胞/mL接種于6孔板持續(xù)培養(yǎng)10～14 d，觀察克隆出現(xiàn)日期及生長情況，大于50個細(xì)胞的集落算一個克隆，加固定液，1 mL/孔搖床上放置10 min后，加1 mL/孔結(jié)晶紫染色，計算每個孔的克隆數(shù)并拍照。

5.實時熒光定量PCR（qPCR）

采用Trizol法提取HCCLM3細(xì)胞樣本中的總RNA，根據(jù)qPCR 體系說明書檢測各組樣本中KRT23 mRNA相對表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct方法計算分析各組樣本中KRT23表達(dá)水平。

6.蛋白免疫印跡法

用蛋白裂解液裂解、提取各組HCCLM3細(xì)胞總蛋白，濃度測定用 BCA 法測定蛋白濃度。每組各取30 μg進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn) PVDF膜、奶粉封閉、一抗KRT23抗體（1∶1 500）和GAPDH抗體（1∶3 000） 孵育、二抗山羊抗兔HRP抗體（1∶3 000） 孵育、ECL 發(fā)光液顯色步驟依次進(jìn)行實驗檢測蛋白表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用 Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布的計量資料用表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，采用配對t檢驗分析癌組織和癌旁組織間的差異。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、KRT23在人類肝癌組織高表達(dá)

通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)KRT23在肝癌中表達(dá)高于正常對照（圖1A），在組織樣本中蛋白免疫印跡法檢測KRT23蛋白表達(dá)高于癌旁對照組織（圖1B），且qPCR檢測KRT23 mRNA表達(dá)高于癌旁對照組織（圖1C），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）。

二、KRT23過表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖能力

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通過qPCR及蛋白免疫印跡法檢測KRT23過表達(dá)組（HCCLM3-KRT23）與載體對照組（HCCLM3-vector）及KRT23干擾組（HCCLM3-KRT23/RNAi）與其干擾對照組（HCCLM3-RNAi-vector）中KRT23基因（圖2A）及蛋白（圖2B）表達(dá)情況，經(jīng)過MTT檢測發(fā)現(xiàn)在HCCLM3細(xì)胞中KRT23過表達(dá)組中細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于過表達(dá)對照組，而KRT23干擾后細(xì)胞增殖能力弱于干擾對照組（圖2C）；通過克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)KRT23過表達(dá)組中細(xì)胞克隆形成能力強(qiáng)于過表達(dá)對照組，而KRT23干擾后細(xì)胞克隆形成能力低于干擾對照組（圖2D），2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0. 05）。

三、KRT23通過激活A(yù)KT信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖

通過基因富集分析（GSEA）發(fā)現(xiàn)KRT23富集AKT信號通路相關(guān)分子，且與KRT23的表達(dá)正相關(guān)（圖3A）。通過蛋白免疫印跡法發(fā)現(xiàn)載體對照組（HCCLM3-vector）相比KRT23過表達(dá)組（HCCLM3-KRT23）中p-AKT表達(dá)明顯增高，然而KRT23的干擾組（HCCLM3-RNAi-vector）中p-AKT蛋白的表達(dá)水平低于干擾對照組（HCCLM3-RNAi-vector）（圖3B）；通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)與過表達(dá)載體對照組（HCCLM3-ector）相比，KRT23過表達(dá)組（HCCLM3-KRT23）中細(xì)胞周期相關(guān)分子CyclinD1表達(dá)增強(qiáng)，而細(xì)胞周期抑制分子p21表達(dá)降低；反之在KRT23的干擾組（HCCLM3-RNAi-vector）與干擾對照組（HCCLM3-RNAi-vector）中細(xì)胞周期相關(guān)分子CyclinD1表達(dá)降低，而細(xì)胞周期抑制分子p21表達(dá)升高（圖3C）。

四、KRT23促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖依賴于AKT信號通路

為了進(jìn)一步驗證KRT23通過AKT信號通路影響細(xì)胞增殖能力，我們在KRT23過表達(dá)細(xì)胞中用AKT信號通路抑制劑（LY294002）刺激后，通過MTT及克隆形成實驗檢測發(fā)現(xiàn)，AKT通路抑制劑刺激后細(xì)胞活力受到抑制（圖4A），同時細(xì)胞克隆數(shù)明顯降低（圖4B）。

討論

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，盡管肝切除術(shù)、射頻消融、肝移植等治療方法取得了重大進(jìn)展，但由于肝癌早期發(fā)現(xiàn)較難，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，這使得肝癌成為世界范圍內(nèi)最棘手的腫瘤之一［7］。越來越多的證據(jù)表明，癌基因和腫瘤抑制因子的異常表達(dá)可能在肝癌發(fā)展進(jìn)程中起著不可或缺的作用［8-9］。KRT23引起了我們的注意，因為有報道證實KRT23可作為肝癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物［4］。然而KRT23在肝癌中的調(diào)節(jié)功能尚未有相關(guān)報道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)KRT23在肝癌中升高，通過MTT及克隆形成實驗表明在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)KRT23可促進(jìn)細(xì)胞增殖。

目前已有文獻(xiàn)報道，腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展與PI3K/AKT信號通路相關(guān)［10-12］。同時許多研究發(fā)現(xiàn)AKT信號通路的激活對腫瘤細(xì)胞增殖，自噬調(diào)節(jié)等具有重要的作用［13］。與此同時，許多研究表明PI3K/AKT信號通路與肝癌密切相關(guān)。上述研究提示在肝癌中AKT信號通路的激活對肝癌的進(jìn)程有重要作用。

本研究通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)KRT23高表達(dá)與AKT信號通路的基因富集正相關(guān)。過表達(dá)KRT23后p-AKT活性增強(qiáng)，且細(xì)胞周期蛋白cyclinD1表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞周期抑制分子p21表達(dá)下降。在KRT23高表達(dá)的基礎(chǔ)上聯(lián)合AKT抑制劑處理，細(xì)胞增殖能力降低。本研究證明 KRT23是肝癌中潛在的癌基因，并且能通過激活A(yù)KT 信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。因此，KRT23可能成為新的干預(yù)和治療肝癌的潛在靶點。然而，我們的研究還存在不足，缺少KRT23在體內(nèi)對腫瘤的影響研究及KRT23對AKT信號通路調(diào)節(jié)的機(jī)制研究。這也是我們未來研究應(yīng)側(cè)重于KRT23影響肝癌進(jìn)程的機(jī)制。

綜上所述，KRT23可通過調(diào)節(jié)AKT信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，為KRT23可以作為肝癌診斷及治療的潛在靶點提供理論支持。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-12-11）

（本文編輯：楊江瑜）