Fe(II)EDTA 絡合吸收耦合H2-MBfR 處理NO 效能

劉婉婷,錢飛躍,2,趙俊杰,徐正慧,王建芳,2,*,繆潤珠(.蘇州科技大學環境科學與工程學院,江蘇 蘇州 25009；2.城市生活污水資源化利用技術國家地方聯合工程實驗室,江蘇高校水處理技術與材料協同創新中心,江蘇 蘇州 25009；.蘇州科技大學天平學院,江蘇 蘇州 25009)

大氣中的氮氧化物(NOx)主要來源于各種運輸活動及工業過程,尤其是燃煤發電廠或鍋爐的工業煙氣[1].NO 是NOx的主要成分,在煙氣中約占90%[2].近些年來,選擇性催化還原(SCR),選擇性非催化還原(SNCR),吸附和吸收等方法被陸續用于NOx的去除[3-5],然而這些控制策略存在高成本、低效率等弊端.NOx生物去除技術運營成本低、能源低以及產生的二次污染少.化學吸收-生物還原(CABR)使用亞鐵乙二胺四乙酸酯(Fe(II)EDTA)作為溶劑快速吸收NO,利用反硝化細菌將NOx還原為無害的N2的同時,實現Fe(II)EDTA 的再生[6].由于工業煙氣通常含有3%～8%的O2,會導致Fe(II)EDTA很容易被氧化成Fe(III)EDTA,進而使NO 無法與之發生絡合反應,嚴重影響處理效率.該技術的關鍵過程是Fe(II)EDTA的再生,涉及Fe(III)EDTA 和Fe(II)EDTA-NO 向Fe(II)EDTA 的生物轉化.

CABR 雖然性能穩定且操作簡便,但仍存在氣液傳質效率低,生物膜堵塞等問題[7].此外,Fe(II)EDTA 再生緩慢會導致NO 去除率降低[8],且Fe(III)EDTA 和Fe(II)EDTA-NO 還原分別需要反硝化和鐵還原微生物.氫基質膜生物膜反應器(H2-MBfR)利用清潔的H2作為電子供體,采用無泡曝氣的方式,提高了氣體傳質效率及H2利用率[9].H2-MBfR 的無泡曝氣技術和絡合劑Fe(II)EDTA 的使用,可有效改善NO 氣液傳質效率低的問題[10].一體化絡合吸收- H2-MBfR 的快速啟動及維持反應器內Fe(II)EDTA 濃度是增強處理效果的關鍵因素[11],關于以H2為電子供體的混合功能微生物培養研究較少.目前研究人員利用膜改性方法改變中空纖維膜絲的表面特性[12-13]縮短啟動時間;添加還原性金屬[14-15];利用生物膜電極反應器[16-17];混合吸收劑(Fe(II)Cit/Fe(II)EDTA)[18]等加速Fe(II)EDTA 再生.然而,這些方法的局限性也相對明顯,例如加劇膜污染,能耗和成本偏高,可持續性較差.本研究構建Fe(II)EDTA 絡合吸收NO 耦合H2-MBfR 還原一體化系統,通過啟動H2-MBfR,馴化具有同步反硝化及鐵還原性能混合菌種,探究在H2-MBfR 體系中,H2作為唯一電子供體的反硝化和鐵還原效能以及NO的去除效率,研究進水Fe(II)EDTA 濃度、pH 值對一體化系統中NO 去除效率的影響,分析微生物群落結構特征.

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

本實驗使用雙管式MBfR,分別命名為A 管和B管,A 管通入H2(氫氣發生器QL-300 7350,山東賽克賽斯),B 管通入NO(河南源正),通過蠕動泵(Longer,China)促進反應器內液體循環.反應器總體積為80mL,有效容積60mL,反應器內徑1.2cm,高度36cm.實驗用膜絲(830Y-0.20,日本杜邦帝人)單組含有32根PVDF 中空纖維膜,膜內徑250μm,外徑350μm,膜絲表面積為13.5cm2,具體裝置如圖1 所示.

圖1 H2-MBfR 反應器裝置圖Fig.1 Diagram of H2-MBfR reactor installation

1.2 實驗水質

采用實驗室人工模擬廢水,由NaNO3,KH2PO4,K2HPO4及微量元素組成,NaHCO3作為唯一無機碳源,投加量20mg/L.Fe(III)EDTA 由FeCl3·6H2O,乙二胺四乙酸四鈉按比例配置而成.

為維持微生物生長,在模擬廢水中投加微量元素:1.98mg/L MnCl2·4H2O,0.5mg/L CuSO4·5H2O,0.44mg/L Na2MoO4·2H2O,0.38mg/L NiCl2·6H2O,0.028mg/L H3BO3,0.2mg/L ZnSO4·7H2O,0.002mg/L CaCl2·2H2O,0.1mg/L MgCl2.

1.3 實驗試劑

NaNO3(≥99.0%);NiCl2·6H2O(≥98.0%);ZnSO4·7 H2O(≥99.5%)及CaCl2·2H2O(≥74.0%)均購買自上海凌峰化學試劑有限公司.KH2PO4(≥99.5%);K2HPO4(≥99.0%);FeCl3·6H2O(≥99.0%);乙二胺四乙酸四鈉(≥99.0%);MnCl2·4H2O(≥99.0%);CuSO4·5H2O(≥99.0%);Na2MoO4·2H2O(≥99.0%);MgCl2(≥99.0%)均購買自天津市科密歐化學試劑有限公司.NaHCO3(≥99.5%);H3BO3(≥99.0%)均購買自無錫市晶科化工有限公司.所有藥品的純度均為AR.NO 濃度為400×10-6(3.01%,河南源正).

1.4 分析項目及檢測方法

1.4.1 水樣測試指標及方法 本實驗通過無菌注射器取樣,水樣經過0.45μm 水系PES 濾膜過濾.硝態氮采用紫外分光光度法HJ/T 346-2007 測定;亞硝態氮采用N-(1-奈基)-乙二胺分光光度法測定;pH 值采用pH 計(BestLab 962244)測定;NO 采用煙氣分析儀(testo 340)測定;Fe(II)EDTA 采用1,10-菲羅啉分光光度法測定[19];Fe(II)EDTA-NO 采用分光光度法進行測定[20];總鐵濃度采用鄰菲羅啉分光光度法測定[21].

1.4.2 生物膜樣品的采集與16S rRNA 高通量測序分析 取同步反硝化鐵還原階段第27d 膜絲表面的生物膜樣,命名為DQ;一體化系統第50d 膜絲表面的生物膜樣,其中與溶液相接觸的生物膜樣,命名為DS,A 管供氫側與中空纖維膜接觸的生物膜樣,命名為DH,B 管通NO 側與中空纖維膜接觸的生物膜樣,命名為DN,共4 個生物膜樣品.

4 組生物膜樣品送至美吉公司進行16S rRNA高通量測序分析. 16S rRNA 基因在V3～V4 高變區測序,選用細菌通用引物 338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)及806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’).在優化序列的基礎上按照97%相似性分析,得到每個OTU 對應的物種分類信息,并在各水平上統計每個樣品的群落組成,獲得樣品中微生物門(phylum)和屬(genus)等物種組成及豐 度.

1.5 數據處理

1.6 實驗方法

1.6.1 反應器運行 本實驗主要分為2 個階段:菌種馴化及生物膜培養(S1)、構建Fe(II)EDTA 絡合吸收NO 耦合H2-MBfR 還原一體化系統(S2).其中菌種馴化階段(S1)分為兩個部分:馴化具有氫自養反硝化能力的菌種及生物膜培養(S1-SR),馴化具有同步反硝化及鐵還原能力的混合菌種(S1-SF).

反應器接種來自蘇州某污水廠厭氧污泥,接種污泥濃度為5000mg/L,S1 階段在A 管和B 管的PVDF 膜內通入H2,氫分壓維持在0.06MPa.S2 階段A 管通入H2,氫分壓為0.06MPa,B 管通入400×10-6的NO,分壓維持在0.06MPa.本實驗控制進水pH 值為6.8～7.0,HRT 設置為8h.內循環泵流速維持在72mL/min 以保障A 管和B 管基質與生物膜良好接觸.保證反應器內氫通量JH2 為0.096g H2/(m2·d),NO通量 JNO為0.117g NO/(m2·d).

S1-SR 階段:為了更好地掛膜,初期采用間歇式運行反應器,HRT 為48h.運行2d 后,HRT 縮短至24h,間歇運行3d,PVDF 膜上附著一層生物膜,進一步縮短HRT 至8h,運行3d,反應器轉為連續運行,并逐漸提高進水硝酸鹽的濃度.直到 NO3--N 提高至5mmol/L,硝酸鹽去除率穩定,則認為已完成氫自養反硝化微生物馴化及效能提升.之后實驗維持HRT為8h 不變.

S1-SF 階段:在H2-MBfR 具有穩定反硝化性能的基礎上,在反應器內加入不同濃度的Fe(III)EDTA,培養具有同步反硝化及鐵還原能力的生物膜,探究同步反硝化與鐵還原的性能.

S2 階段:在具有良好的同步鐵還原和反硝化性能的H2-MBfR 的基礎上,調整進水濃度及配比.通過系統還原Fe(III)EDTA 產生的Fe(II)EDTA 絡合NO,逐漸降低硝酸鹽基質濃度,構建Fe(II)EDTA 絡合吸收NO 耦合H2-MBfR 還原一體化系統,探究絡合吸收、反硝化與鐵還原以及整體系統對NO 的去除能力.

1.6.2 批次實驗 在具有良好性能的Fe(II)EDTA絡合吸收NO 耦合H2-MBfR 還原一體化系統的基礎上,控制pH 值在6.8～7.0,探究初始Fe(II)EDTA 濃度(1,3,5,10mmol/L)對系統的影響.保持初始Fe(II)EDTA 濃度為5mmol/L,HRT 為8h,通氣壓力0.06MPa,探究pH 值(6,7,8,9)對系統的影響.

表1 實驗條件Table 1 Experimental conditions

2 結果與討論

2.1 氫自養反硝化菌種馴化(S1-SR 階段)

在圖1 所示反應器內,雙管都通入H2,進行氫自養反硝化菌種的馴化及生物膜的培養.考慮到后期一體化系統的構建,在保證充足電子供體的前提下,提升硝酸鹽濃度至5mmol/L.滿足在單管供氫的工況下,進水硝酸鹽能夠被完全消耗,確保氫自養反硝化菌種的活性.

由圖2 可以看出,氫自養反硝化菌逐漸適應進水基質,隨著進水硝酸鹽濃度從1mmol/L 提升到5mmol/L,硝態氮去除率整體呈現先快速提升,后維持平穩的趨勢.在硝酸鹽濃度達到5mmol/L 時(R5 階段),硝態氮去除率維持在98.93%以上.H2-MBfR 能夠在短時間內啟動且具有較高的脫氮效率[22].值得注意的是當硝酸鹽濃度由1mmol/L 提升到2mmol/L時,硝態氮去除率出現下降趨勢,在第10d 的時候出現最低去除率,為84.06%,這主要是因為在馴化初期,反硝化菌性能不穩定.而當進水硝酸鹽濃度超過2mmol/L 后,硝態氮去除率波動較小,表明微生物逐步適應環境及進水基質,表現出穩定的氫自養反硝化性能,此階段反應器完成掛膜.

圖2 H2-MBfR 反硝化啟動及效能變化Fig.2 Denitrification initiation and efficiency changes in H2-MBfR

在第32d 于反應器內進行原位批次實驗,進水硝酸鹽濃度為2mmol/L.由圖3 可以看出,隨著時間的增加,硝態氮去除率逐漸增加.60min 后,反應速率的變化較小.在180min 時,硝態氮去除率達到100%,說明此時反應系統內的硝酸鹽已經被微生物全部消耗,進一步驗證了此時反應器內馴化完全的微生物具有高效的反硝化性能,能夠滿足后續實驗需求.硝酸鹽去除速率隨著時間的增加呈現先增加后減小的趨勢,在 30min 時獲得最大去除速率為0.38mmol/(L·min).說明反應器內馴化完全的微生物,其反硝化效能達到穩定.

圖3 第32d H2-MBfR 反硝化批次實驗Fig.3 Day 32d enitrification batch experiments in H2-MBfR

2.2 馴化具有同步反硝化及鐵還原能力的混合菌種(S1-SF 階段)

改變進水工況,馴化具有同步反硝化及鐵還原能力的混合菌種,如圖4 所示.F1 階段(1～12d)設置進水Fe(III)EDTA 為5mmol/L,NO3--N 為1mmol/L.運行過程中發現,混合體系中硝酸鹽優先還原,當監測到出水中有Fe(II)EDTA 時,硝酸鹽及亞硝酸鹽濃度基本消耗至0mg/L.硝酸鹽在反應器中作為第一電子受體,能夠優先利用H2進行還原[23].

圖4 H2-MBfR 同步反硝化及鐵還原效能Fig.4 Simultaneous denitrification and iron reduction efficiency in H2-MBfR

F1 階段,在反應第1d 出水Fe(III)EDTA 的濃度快速降至0.39mmol/L,還原率達到90.87%,表明部分反硝化菌具有一定的鐵還原性能,因此能夠在工況改變的初期保持較高的鐵還原率.在2～12d之間,出水Fe(III)EDTA 濃度穩定在0.20mmol/L 以下,鐵還原率最大值出現在第7d,為99.84%,此階段微生物已經適應環境內Fe(III)EDTA 濃度.在第13d,將進水Fe(III)EDTA 濃度提高至10mmol/L,同時進水硝酸鹽濃度提升至2mmol/L(F2 階段).此時出水 Fe(III)EDTA 出現小幅度提升,出水中Fe(II)EDTA 濃度有所下降,鐵還原率也降至91.19%,隨后出水Fe(II)EDTA 開始逐步提升,最終達到穩定.在 21d 時,鐵還原率出現最大值為98.06%,這也表明0.06MPa 的氫分壓可以提供充足的電子供體.

以上結果表明,H2-MBfR 通過快速富集反硝化菌,實現同步反硝化和鐵還原的功能.當實驗進行28d 后,鐵還原效率維持高水平,因此認為同步反硝化和鐵還原混合菌種馴化及生物膜掛膜完成.

2.3 Fe(II)EDTA 絡合吸收NO 耦合H2-MBfR 還原體系對NO 的去除效能(S2 階段)

直接在體系內通入NO,監測一體化體系對NO的去除率,逐步利用Fe(II)EDTA-NO 替代硝酸鹽.由圖5 可知,在A1 階段(1～10d)連續通入400×10-6的NO,為保證反硝化微生物在耦合初期還能維持活性,進水Fe(III)EDTA 為10mmol/L,進水NO3--N 為2mmol/L.運行的第1d,出水Fe(II)EDTA 濃度維持在9.04mmol/L 以上,NO 去除率為90.87%.隨著運行時間的增加,出水Fe(II)EDTA 濃度及NO 去除率逐漸增加.在第10d,出水Fe(II)EDTA 濃度及NO 去除率分別為9.61mmol/L 和99.50%.說明Fe(II)EDTA 絡合吸收耦合H2-MBfR 還原體系能夠做到對NO 的高效且穩定的去除.

圖5 Fe(II)EDTA 絡合吸收NO 耦合H2-MBfR 還原一體化系統脫氮效能Fig.5 The removal efficiency of NO by Fe(II) EDTA complexing absorption coupled with H2-MBfR reduction integrated system

A2 階段(11～21d)降低進水 Fe(III)EDTA 至5mmol/L,進水NO3--N 降低至1mmol/L,考察進水Fe(III)EDTA 濃度對NO 去除效率的影響.改變運行工況初期,出水Fe(II)EDTA 濃度及NO 去除率發生明顯波動,出水Fe(III)EDTA 濃度也有所提升.此時Fe(II)EDTA 生成量最小值為3.32mmol/L,NO 去除率最小值為89.11%.考慮是由于進水Fe(III)EDTA濃度下降,導致生成的Fe(II)EDTA 濃度降低,發生短暫波動.在此工況下運行15d 后,微生物逐步適應Fe(III)EDTA 濃度降低,出水Fe(II)EDTA 濃度明顯回升,同時NO 去除率也開始穩步提升.出水Fe(II)EDTA 最大值為 4.76mmol/L,NO 去除率最高為97.24%.

A3 階段(22～36d),不再投加硝酸鹽,進水Fe(III)EDTA 濃度維持5mmol/L 不變.出水Fe(II)EDTA略有下降,下降至3.32mmol/L,NO去除率下降至94.20%.此時生成的Fe(II)EDTA 濃度與工況改變前的濃度存在差距,但與第11d 的NO 去除率明顯下降不同,第22d 的NO 去除率只降低了2.98%.考慮是由于A2 階段不僅減少了硝酸鹽投加量,同時進水Fe(III)EDTA 濃度的降低導致了絡合劑的Fe(II)EDTA 生成量減少.體系內Fe(II)EDTA 濃度的降低直接導致了NO 去除率的明顯減低.A3 階段保持進水Fe(III)EDTA 濃度不變且不再投加硝酸鹽.Li等研究證明,反硝化菌能夠有效還原Fe(II)EDTANO,因此在前期減少硝酸鹽投加量,促使反硝化菌逐步適應,提高對Fe(II)EDTA-NO 的還原效率[24].而在之后的批次實驗中發現,6h 內Fe(II)EDTA-NO 濃度快速下降,證實了前期論述,此時反硝化菌能夠高效還原Fe(II)EDTA-NO,加快Fe(II)EDTA 的循環再生,達到NO 的高效去除.由此可以推斷,此時改變系統的運行工況,不易影響 NO 去除率.維持出水Fe(II)EDTA 穩定后,NO 去除率也隨之穩定,說明在電子供體供應充足的條件下,本系統能夠實現穩定高效去除NO.

A4 階段(37～51d),進一步降低進水Fe(III)EDTA濃度至1mmol/L,考察低進水Fe(III)EDTA 濃度下的影響.第37d,出水Fe(II)EDTA 濃度為0.77mmol/L,NO 去除率明顯下降至69.85%.隨著反應時間的增加,NO 去除率最大值為82.21%.出氣端NO 濃度提升,說明NO 去除不完全,可能是體系內絡合吸收劑Fe(II)EDTA 不足造成.進水Fe(III)EDTA 的減少,導致生成的Fe(II)EDTA 不足,能夠吸收的NO 總量下降,最終導致NO 去除率的下降.Zhao 等研究表明,Fe(II)EDTA 濃度是吸收 NO 的關鍵,體系內高Fe(II)EDTA 濃度能夠加快NO 的去除[17].反之,低Fe(II)EDTA 濃度會導致NO 去除量減少,驗證了A4段的實驗結果.

綜上所述,保證體系內具有一定濃度的Fe(II)EDTA,是保證Fe(II)EDTA 絡合吸收NO 耦合H2-MBfR 還原一體化系統穩定、高效去除NO 的關鍵因素之一.

2.4 各類體系中Fe(II)EDTA-NO 還原效率比較

如表2 所示,生物膜電極反應器對Fe(II)EDTANO 去除率僅在79.1%[17].而Xia 等雖然對反應器進行了優化,提升了Fe(II)EDTA-NO 的去除率,但遠沒有一體化體系更為穩定高效[25].利用還原劑[26-28]、金屬鐵粉[29]及鋅粉[15]對Fe(II)EDTA-NO 進行還原再生,都存在去除效率較低的問題,而金屬粉末易氧化失效,從而喪失循環利用的能力.本研究采用Fe(II)EDTA 絡合吸收NO 耦合H2-MBfR 還原一體化系統,可以更為穩定高效的去除 NO,實現Fe(II)EDTA 快速循環再生.

表2 不同體系中Fe(II)EDTA-NO 還原對比Table 2 Comparison of Fe(II)EDTA-NO reduction in different systems

2.5 影響因素

2.5.1 進水Fe(II)EDTA 濃度對NO 去除率的影響由圖6(a)可以看出,在60min內基本實現Fe(II)EDTA消耗完全.由圖6(b)可知,體系中Fe(II)EDTA-NO 濃度持續增加.隨著初始Fe(II)EDTA 濃度的增加,60min 時體系中Fe(II)EDTA-NO 濃度也隨之提升,說明初始Fe(II)EDTA 濃度越高,能夠吸收的NO 總量越大,有利于體系對NO的快速去除.由圖6(c)可以看出,初始Fe(II)EDTA 濃度越高,體系內的NO 平均去除速率越高.在Fe(II)EDTA 濃度為10mmol/L 時,達到最大去除速率為 44.68mg/(m3·h). 初始Fe(II)EDTA 濃度5mmol/L 和10mmol/L 時,其NO 平均去除速率差別較小,認為在此NO 濃度及進氣流速限制下,5mmol/L 的Fe(II)EDTA 即能達到良好的NO 去除效果,因此增加初始Fe(II)EDTA 濃度,NO 的平均去除速率未出現提升[31].

圖6 初始Fe(II)EDTA 濃度對NO 去除的影響Fig.6 Effect of initial Fe(II)EDTA concentration on NO removal

在圖6(d)中,Fe(II)EDTA-NO 積累速率出現先上升再下降的趨勢,且Fe(II)EDTA 濃度越高,生成速率越高,Fe(II)EDTA-NO 在初期運行的第10min內快速積累,積累速率分別為0.039,0.075,0.129 和0.185mmol/(L·min),此時吸收速率高于生物還原速率.隨著反應時間延長,Fe(II)EDTA-NO 濃度下降,表明高濃度的初始Fe(II)EDTA 有利于NO 的快速絡合.

體系中 Fe(II)EDTA-NO 最終濃度與初始Fe(II)EDTA 濃度之間存在差異,認為是由于反應器內生成 Fe(II)EDTA-NO 的同時,也發生著部分Fe(II)EDTA-NO 的還原.測定的出水Fe(II)EDTANO 濃度為體系內的積累量,即生成量與消耗量的差值,因此會與初始Fe(II)EDTA 濃度存在差異.

2.5.2 進水pH 值對NO 去除效率的影響 由圖7(a)可以看出,pH 值越高,相同反應時間體系內剩余Fe(II)EDTA 濃度越高,說明 pH 值能夠影響Fe(II)EDTA 對NO 的吸收能力.圖7(b)可以看出,pH值越高,體系中Fe(II)EDTA-NO 濃度越小.當pH 值為 6 時,Fe(II)EDTA-NO 的即時濃度最高,達4.24mmol/L.隨著pH 值的提升,體系中Fe(II)EDTANO 濃度也隨之降低.pH 值為9 時,Fe(II)EDTA-NO濃度為 0.89mmol/L,表明 pH 值過高不利于Fe(II)EDTA 對NO 進行絡合,符合前期分析.由圖7(c)可以看出,隨著pH 值的升高,NO 的平均去除速率逐漸下降.當pH 值為6 時,NO 平均去除速率明顯高于其他三組,為43.86mg/(m3·h).當pH值提高至9時,NO平均去除速率明顯下降,僅為pH 值為6 時的50%左右,為23.66mg/(m3·h).

圖7 進水pH 值對NO 去除的影響Fig.7 Effect of influent pH on NO removal

根據實驗結果分析可知,Fe(II)EDTA 充足情況下,與NO 的絡合能力同樣影響著一體化反應體系對NO 的去除.Fe(II)在偏酸性的環境下更容易與EDTA 形成螯合物[32].殷祥男等研究發現 pH>8時,Fe(II)EDTA 對NO 的絡合能力對比pH 值在6～8時出現下降,NO 的吸收速率較低[33].pH 值過高時Fe(II)EDTA 的穩定性降低,游離的Fe2+會與溶液中的OH-生成Fe(OH)2沉淀,從而失去對NO 的絡合吸收能力[34].當系統內環境呈堿性時,會造成EDTA 的降解[35],降低參與反應的Fe(II)EDTA 濃度,從而影響對NO 的去除能力.且H2溶于水,以H+作為電子供體被利用,因此更適應偏中性的環境[36].

研究表明,pH>8.4 時,反硝化關鍵酶的活性會受到影響[33],進水pH 值過高會導致微生物還原能力受到抑制.由圖7(d)可知,隨著pH 值的提升,體系中Fe(II)EDTA-NO 積累速率逐漸降低,進水pH 值為9時,最高Fe(II)EDTA-NO積累速率遠低于進水pH值為6 時的積累速率.

pH 值控制為6 時,系統快速生成Fe(II)EDTANO 的同時,也被微生物快速還原,實現Fe(II)EDTA的高速循環再生.在此條件下,Fe(II)EDTA 與Fe(II)EDTA-NO 維持穩定的平衡.過高的pH 值會嚴重影響微生物活性及絡合吸收劑Fe(II)EDTA 的吸收效率,從而影響NO 的去除.將pH 值調控在6 左右,有利于一體化系統高效去除NO.

2.6 微生物群落分析

2.6.1 微生物群落多樣性分析 由表3 可知,4 個樣品中的微生物測序樣本覆蓋率較高,均大于0.99,所測微生物多樣性數據具有說服力.Simpson 指數值排序為:DH>DN>DS>DQ,說明不同位置微生物群落多樣性存在細微差距,與H2接觸近的組分物種豐度較高,但沒有明顯差異.Chao 指數能夠有效估計物種數量,從Chao 指數分析,DS、DH、DN 無明顯差異,但遠高于同步反硝化及鐵還原階段.這是由于通入NO后,體系內反硝化及鐵還原的反應更為復雜,需要更多的微生物參與到還原過程中,具有硝酸鹽還原功能的Dechlorosoma 及具有鐵還原功能的Geothrix菌屬僅在DS、DH、DN 樣品屬水平中得以發現.梁岑研究發現,Fe(II)EDTA-NO 濃度的升高會導致總的微生物物種多樣性會出現上升趨勢[37].DS、DH、DN 階段的Shannon 指數對比同步反硝化鐵還原階段下降,這是由于NO具有毒性,靠近NO進氣端的微生物受到影響, 后期發現 Lutispora 、Chitinophagaceae、Anaerovorax 等參與氮循環,具有硝酸鹽降解功能的部分菌屬被淘汰.同時NO 與體系中Fe(II)EDTA 結合,使得反硝化及鐵還原代謝途徑進一步增強,反硝化菌及鐵還原菌屬在生存方面的優勢增大,部分不適應環境的微生物,例如Rhodocyclaceae、Aquimonas 即被淘汰,優勢菌種占比上升.Sobs 指數,即生態優勢度指數,數值大小排序為DS>DN>DH>DQ,說明微生物群落內物種數量分布不均勻,優勢菌種占比大,符合預期.

表3 微生物群落α-多樣性分析Table 3 Microbial community α-diversity analysis

2.6.2 門水平微生物群落結構分析 由圖8 可知,變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bateroidota、厚壁菌門Frimicutes 為同步反硝化及鐵還原馴化階段的優勢菌種,分別占比44.1%,17.11%,33.76%.變形菌門Proteobacteria 中包含亞硝化細菌、硝化細菌和反硝化類的細菌,利用進水中的氮元素進行反應活動,促進微生物生長,在調節微生物群落結構方面有重要影響,是體系中的優勢菌種,相對豐度較高[38].擬桿菌門Bateroidota 異養菌,參與氮磷的去除,分解進水中的分子聚合物重新組成溶解性有機物[39].厚壁菌門Firmicutes 是典型鐵還原富集物中的常見菌屬,即鐵還原富集菌群的優勢菌門[40].以上幾類菌種的出現,結合此階段的硝酸鹽及亞硝酸鹽被完全消耗,鐵還原率穩定在98.60%以上,可以從微生物水平表明同步反硝化及鐵還原階段菌群馴化完成,具備反硝化能力和鐵還原能力的微生物具有高豐度,確保了進水硝酸鹽及Fe(III)EDTA 能夠被快速消耗還原.

圖8 同步反硝化及鐵還原階段門水平微生物Fig.8 Microorganisms at the phylum level in the simultaneous denitrification and iron reduction stage

由圖9 可知,在一體化階段,優勢菌種同前一階段相同,但占比出現明顯變化.DS 及DN 階段變形菌門Proteobacteria 及擬桿菌門Bacteroidetes 相對豐度明顯增加.DH 段變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bateroidota、厚壁菌門 Frimicutes 分別占比50.35%,16.43%,14.98%,說明持續通入NO 可以促進反硝化菌種的富集,此階段最低NO 去除率也可達81.20%,由此證明了Fe(II)EDTA-NO 在一體化階段中占比較高時,促進了Proteobacteria 和Bacteroidetes菌種大量繁殖積累.而DN段由于靠近NO側,厚壁菌門Frimicutes 相對豐度有所降低,說明具有鐵還原功能的菌屬對NO 敏感,不適宜在NO 濃度較高的環境中生存.對比之下,DH 段由于靠近供氫端,厚壁菌門Frimicutes 相對豐度對比其他兩組最高,根據前期分析可知, Fe(III)EDTA 與硝酸鹽共存時,微生物優先還原硝酸鹽,然后進行鐵還原.而反硝化過程消耗了大量的電子供體,因此只有在電子供體充足的條件下,鐵還原功能菌屬才能大量繁殖[41].DH 階段厚壁菌門 Frimicutes 相對豐度較高,有利于強化Fe(III)EDTA 還原過程[42],此時出水Fe(III)EDTA 還原率在78.66%以上.

圖9 一體化階段門水平微生物Fig.9 Microorganisms at the phylum level in the integration stage

而與同步反硝化及鐵還原階段相比,變形菌門Proteobacteria 及擬桿菌門Bateroidota,相對豐度有所上升,而厚壁菌門Frimicutes 物種相對豐度下降.而根據前期微生物群落多樣性分析可知,一體化階段三組樣本的微生物數量,都遠高于同步反硝化及鐵還原階段,說明一體化階段更有利于微生物繁殖富集,典型菌種的大量出現也確保了系統對NO 的高效去除,這一微生物特征與NO 去除效能相匹配.

2.6.3 一體化系統進化樹分析 由圖10 可以看出,DS、DH、DN 階段具有相同的菌種,但其豐度有較大差異.nirK 型反硝化菌Rhizobiales 屬于變形菌門Proteobacteria,在DS、DH、DN 階段相對豐度分別為 26.48%,4.81%,9.63%.Hydrogenophaga 屬于Proteobacteria,是典型的厭氧氫自養微生物,利用H2作為電子供體參與硝酸鹽的代謝.在DH 階段相對豐度遠超DS 和DN 階段,對生物膜的形成起到重要作用[43],一體化階段穩定高效的NO 去除率也充分證明了在充足H2供應下,對電子供體敏感的微生物更易富集,獲得更好的處理效果.Desulfitobacterium作為穩定的優勢菌種,屬于Frimicutes,是一種嚴格厭氧菌,在土壤、污泥中廣泛存在,不僅可以利用電子供體還原硝酸鹽,同時具有鐵還原能力[44].此時出水Fe(II)EDTA 濃度與進水Fe(III)EDTA 濃度差值最大僅為0.19mmol/L,說明Desulfitobacterium 作為屬水平的鐵還原功能關鍵菌屬,其較高的相對豐度確保了在一體化階段對Fe(III)EDTA 的還原能力,保障了體系的穩定性.Desulfitobacterium 菌屬的出現也驗證了系統的厭氧狀態.

圖10 一體化階段屬水平進化樹Fig.10 Phylogenetic tree at the genus level in the integration stage

在一體化階段,兼性厭氧菌Dechloromanas 為優勢菌種, 是典型的硝酸鹽還原菌.DH 段Dechloromanas 豐度明顯大于DS、DN 及同步反硝化鐵還原階段,說明菌種易富集在靠近供氫端的位置,能夠獲得充足的電子供體參與硝酸鹽代謝活動.Geothrix 是少數可以利用Fe(III)氧化物進行呼吸的淡水可培養細菌之一[45].DH 段Geothrix 相對豐度明顯大于其余兩組,說明Geothrix 對H2的需求較大,在H2濃度相對較高的膜表面,Geothrix 容易富集,符合前期推論.上述典型菌屬的出現,從微生物水平說明了Fe(II)EDTA 的穩定生成與循環,解釋了一體化階段的高效NO 去除率.

通過對一體化階段3 組樣本的進化樹分析可以發現,除上述分析的菌屬,Bacteroidetes、Sulfuritalea、Sutterellaceae 和Thermomonas 等皆屬于變形菌門Proteobacteria,且相對豐度較高.根據Sun 研究可知,以上皆為典型的反硝化優勢均屬[46],說明變形菌門Proteobacteria 在一體化系統中較為重要,承擔重要功能,其在微生物水平上的高相對豐度確保了一體化階段的反硝化功能.在此階段,最高NO 去除率為97.24%,符合前期分析.

3 結論

3.1 H2-MBfR 采用先培養穩定的反硝化生物膜,再馴化鐵還原菌的方法,可快速成功構建Fe(II)EDTA絡合吸收NO 耦合H2-MBfR 還原體系系統,NO 最高去除率為99.50%.

3.2 提高初始Fe(II)EDTA 濃度,有利于提升NO 吸收量,體系內NO 平均去除速率隨著Fe(II)EDTA 濃度的提升而提升.在Fe(II)EDTA 濃度為10mmol/L時,最大去除速率為44.68mg/(m3·h).控制進水pH 值為6,NO 平均去除速率可達43.86mg/(m3·h),有利于一體化系統絡合吸收和生物還原的良好平衡.

3.3 同步反硝化鐵還原階段與一體化階段優勢菌門均為Proteobacteria、Bacteroidetes 和Firmicutes,豐度占比有差異,分別為44.10%,17.11%,33.76%和50.35%,16.43%,14.98%,兩階段都具有穩定的反硝化及鐵還原效能.

3.4 Proteobacteria 是Fe(II)EDTA 絡合吸收NO 耦合H2-MBfR 還原一體化系統中主導菌門,在各生物膜樣品中豐度均達到50%以上.Hydrogenophaga 是典型的氫自養微生物,具備氫自養反硝化能力,屬于變形菌門Proteobacteria.