畜禽糞便中雌激素污染特征與控制技術研究進展

王俊躍,桑煜龍,王賀飛,凌婉婷(南京農業大學土壤有機污染控制與修復研究所,江蘇 南京 210095)

研究表明,在極低濃度下雌激素就可擾亂野生動物和人類內分泌系統的正常功能[1].多種魚類的發育與繁衍、性別分化、卵黃原蛋白的產生都受到環境中雌激素的影響[2-3].雌激素也對其他生物產生毒害,受環境雌激素的影響,野生青蛙后代種群中性別比例失調[4].高水平雌激素與男性生殖障礙和精子數量、質量下降有關,還會導致女性不孕不育和乳腺癌等疾病發病率增加[5].

環境中的雌激素包括動物體內合成的天然雌激素(雌酮、雌二醇、雌三醇等)和以醫療、飼養、加工等為用途的合成雌激素(炔雌醇、己烯雌酚、雙酚A 等).環境中大部分雌激素源自于動物產生的天然雌激素,尤其是集中飼養的畜禽.世界上分布最廣泛的動物類型是牛、羊、豬和家禽[6].天然雌激素按形態劃分可分為自由態和結合態,相關畜禽體內未被代謝的雌激素隨糞尿排放進入環境中,結合態雌激素通常隨尿液排出,而糞便中存在的雌激素多為自由態[7].有大量研究報道了水環境[8]中,例如,工業廢水、生活污水和地下水中含有雙酚A,而Zhang 等[9]在研究畜禽糞便中雌激素種類的過程中也發現了雙酚A,這可能是畜禽養殖場中動物的食盆或者盛放糞便的塑料容器內表面材料中釋放出來的.炔雌醇、己烯雌酚作為人工合成的口服生物活性雌激素,是牲畜養殖活動中用以促進生長、育肥、誘導發情、預防和治療牲畜生殖障礙比較常見的藥物[10-11],這類藥物經過生物代謝后殘留于畜禽糞便中.不同種類畜禽糞便中雌激素的種類含量不同,明確其污染特征將更有利于推進風險防控和治理工作.

在施加畜禽糞便中的農田土壤和地下水中都檢測到雌激素及其代謝產物[12],在施用糞便農田鄰近的河流、湖泊中也檢測到不同濃度的雌激素,說明雌激素可以在環境中不斷遷移與轉化[13].吸附、膜分離、傳統氧化等物理和化學方法能夠去除環境中的雌激素[14-15].但生物修復因其高效、環保被認為是一種更先進的處理技術.

本文概括了國內外畜禽糞便中雌激素的結構和性質、污染特征和遷移過程的研究進展.列舉了除傳統堆肥之外,高級氧化、微生物等雌激素控制技術,介紹了雌激素降解功能細菌、降解功能菌群和固定化菌劑,評價了功能菌群和固定化菌劑的顯著降解效果和應用潛力.

1 畜禽糞便中雌激素的污染特征

1.1 畜禽糞便中雌激素的結構與性質

畜禽糞便中3 種天然雌激素都是由一個酚環、兩個環己烷和一個環戊烷構成的環戊烷并多氫菲結構,又稱甾體母核.區別在于環戊烷上C16和C17所連基團的位置和數量不同[6],如表1 所示,雌酮在C17上連接一個羰基,雌二醇與雌酮的差異在于C17的羰基變為羥基,羥基在空間位置上的不同形成了兩種立體構型17α-E2 和17β-E2,而雌三醇在C16和C17上都連接一個羥基[16].合成雌激素中炔雌醇由甾體雌激素衍生,具有環戊烷并多氫菲結構.在雌二醇的結構基礎上C17上的氫被乙炔基取代,使得炔雌醇的結構更穩定,在環境中的降解難度更大.雙酚A 的結構與塑化劑較為類似,主要由2 個剛性平面芳環和可塑非線性脂肪鏈構成[17],分子空間結構對稱具有非極性.己烯雌酚是一類合成非甾體雌激素,具有乙烯平面結構,3、4 號位上的氫被兩個羥基苯基取代,p-Π 共軛的結構使得芳香環具備高抗性.

表1 畜禽糞便中雌激素的理化性質[6,15-16]Table 1 Physicochemical properties of estrogens in manure[6,15-16]

如表1 所示,無論是天然或者是人工合成的雌激素,飽和蒸汽壓都較低,揮發作用可忽略不計.天然雌激素的Log Kow(辛醇-水分配系數)較高且水中的溶解度(Sw)較低,因此暴露于環境中易被土壤、糞便中的有機質及其水中的沉積物吸附,而合成雌激素像炔雌醇和己烯雌酚也具有相似的性質.雙酚A 可作為某些塑料制品的原材料和抗氧化劑,A 對小鼠具備雌激素的效應[18],能夠與人體細胞的雌激素受體結合,產生雌激素活性,因此雙酚A 被列為雌激素.

1.2 畜禽糞便中雌激素的種類和含量

畜禽糞便中雌激素的種類和含量因畜禽類型的不同而產生差異,對比國內外不同畜禽糞便中雌激素的污染特征,結果如表2.根據調查的數據(采用均值作比較)發現牛糞中的雌激素主要為E1 和17β-E2,濃度分別為265.56,102.52μg/kg,這與Li 等[19]的研究結果相符,他們發現牛糞便中90%的雌激素為E1 和E2.與其他畜禽相比,豬糞便中雌激素的濃度普遍偏高,E1 和E2 濃度高達1052.81,266.29μg/kg,這可能是因為豬的尿液和糞便長期共存,導致檢測的雌激素含量偏高.雞鴨糞便中雌激素主要以E3 為主,濃度均值可達 121.01,111.6μg/kg.為了提高畜禽產量和質量,EE2、BPA 等合成雌激素通常被添加到飼料中,因此在畜禽糞便中可以檢測到合成雌激素的存在,畜禽糞便中合成雌激素的量遠低于天然雌激素,這與大部分關于畜禽糞便中雌激素含量的研究結果相符.

表2 畜禽糞便的雌激素濃度(μg/kg)[9,20-28]Table 2 Concentration of estrogens in manure(μg/kg)[9,20-28]

對于同種畜禽,生長階段和性別差異等因素對其糞便中雌激素含量也有很大影響.在Abdellah 等[6]的研究中發現懷孕期間牛糞便中總雌激素的日排泄量為256～7300μg/d,而未懷孕牛的雌激素日排泄量低于200μg/d,說明懷孕期間雌激素排泄量遠高于平時.由于人類的需求,家養畜禽往往會有不同用途,這也影響了其糞便中雌激素的含量,奶牛產生的雌激素明顯高于肉牛,蛋雞的游離激素含量也高于肉雞.在Zhang 等[20]的研究中發現雄性肉雞糞便中雌激素日排泄量低于檢出限,而雌性肉雞和蛋雞糞便中的游離雌激素排泄量為 2.79～3.28 和 2.04～8.59μg/d.在表3 中根據文獻總結了不同畜禽在不同差異下的雌激素日排泄量的估計值,但這些數據只代表了少數幾類動物,并且如飲食習慣、季節變化、健康狀況等情況都很難考慮進去,對于了解動物雌激素的貢獻有限,未來還需更多關于此方面的研究.

表3 不同生理階段的畜禽糞便中雌激素日排泄量(μg/d)[9,20,25,28]Table 3 Daily excretion of manure at different physiological stages(μg/d)[9,20,25,28]

1.3 畜禽糞便中雌激素的遷移特征

畜禽養殖場以及施用過糞肥的農田周圍的土壤、地下水、地表徑流中都發現了不同程度的雌激素污染.比如,在施用動物糞便的地區地下水中發現17β-E2[29].全球多個國家都報道了不同程度的地表水雌激素污染,尤其集中在人口眾多、經濟發達的國家和地區.在中國,Li 等[30]預測了長江流域糞源性雌激素濃度,長江上中下游的平均雌激素活性當量(EEQ)分別為2.13,3.49,9.36ng/L,其中江蘇省的EEQ預測值最高,為16.65ng/L.Luo[31]調查了美國喬治亞州流域受家禽排泄物影響的河流中4 種雌激素污染狀況,約有1/6 的水樣中檢測到雌激素的量高于定量限,E1、E2、E3 的平均濃度分別為1.85,4.69,5.04ng/L,尚未檢測到EE2 的存在.然而,世界范圍內對畜禽糞便中雌激素的遷移機制的研究還很有限.

雌激素在遷移過程中易受環境中多種因素的影響.Chambers 等[32]研究發現糞便中的溶解性組分和膠體組分對于雌激素的遷移及生物活性有顯著影響,在高含量有機質的影響下,雌激素更傾向于與其中的溶解性組分結合,且結合后仍具有較高的生物活性,這也解釋了畜禽糞便中雌激素易向其他環境發生遷移的原因.殘留在農田中的雌激素會隨著淋溶作用向下層土壤遷移,Xu 等[33]發現土壤的有機質含量和水利條件是影響雌激素遷移的主要因素,土壤有機質含量高的土壤通常具有較高的淋溶性.Langwaldt 等[34]的研究中發現雌激素向土壤下層遷移時會在含水層以溶解的形式滲入到地下水,由于溶解氧不足等不利的條件,地下水中的雌激素難以消減而導致持續存在長達數月.遷移過程中雌激素在不同環境中活性和形態發生轉變,未來對于畜禽糞便中雌激素的環境行為研究具有重要的環境意義.

2 畜禽糞便中雌激素的控制技術

2.1 好氧堆肥

堆肥因其操作便捷、處理規模大、對雌激素的降解能力強而受到人們的廣泛關注[6].已有部分研究揭示了好氧堆肥具有較好的雌激素去除效果,Han等[35]測定了雞糞、牛糞、豬糞堆肥后的雌激素含量變化,堆肥32d 后,雞糞中E3、17β-E2、EE2 去除率分別為90.0%、54.5%、93.3%,而豬糞中17β-E2、E3 的去除率為91.2%和63.7%,牛糞在堆肥16d時,17β-E2 和E3 的去除率為90.3%和87.4%,32d 后已經檢測不到雌激素存在,并且發現堆肥過程中雌激素的降解速度呈現先升高后降低的趨勢.

目前已有報道指出堆肥時外加微生物和吸附材料可以顯著提高堆肥效果[36].Sun 等[37]通過外加微生物菌劑和腐殖酸來提高堆肥的溫度和加速雌激素的降解,他們在低溫條件下將雌激素降解菌和腐殖酸加入到堆肥糞便中,雌激素降解菌增加了總菌群中具有降解和轉化雌激素能力的菌屬,加快了堆肥進程并提高了雌激素降解率,腐殖酸不僅可以加速雌激素的吸附和積累,還能減少氨氮的揮發和豐富糞肥中的養分.Li[38]在研究中發現外加硫也會增加堆肥溫度和減少氨氮的消散,添加量低于5%還促進了對4 種雌激素(E1、17β-E2、E3、EE2)的降解.李欣[39]利用固定化菌劑處理牛糞12h,牛糞中天然雌激素E3、E2、E1 去除96.06%以上,合成雌激素DES 也去除了93.83%.近年來,也有許多關于堆肥與生物炭相互作用[40]的報道,添加生物炭能夠減少溫室氣體的排放、減少肥料需求,同時能增加微生物活性,影響微生物菌群[41].因此,堆肥時添加生物炭固定的雌激素降解菌群將是很有前景的研究方向.

2.2 高級氧化

高級氧化技術應用于新型污染物的降解方面的研究目前受到廣泛關注,污水處理中通常采用過硫酸鹽氧化、芬頓試劑氧化、TiO2光催化氧化、臭氧氧化等技術來去除雌激素,但畜禽糞便中作為雌激素的一個重要源頭,卻很少有關于高級氧化技術直接降解畜禽糞便中雌激素的研究.Sun 等[15]利用芬頓試劑對牛糞中進行處理,反應24h 后糞便中初始濃度為 97.40,96.54,100.22,95.01,72.49mg/kg 的E3、BPA、DES、E2 和EE25 種雌激素去除率分別達到84.9%、99.5%、99.1%、97.8%和84.5%.Wang等[42]優化了芬頓氧化工藝并應用于多種畜禽糞便中雌激素和抗生素的降解,目標污染物的降解率都能達到70%以上.將芬頓氧化工藝與傳統好氧堆肥相結合不僅能更有效去除雌激素,而且綠色環保于環境無害.只有從源頭將雌激素加以控制,才能防止因遷移而造成更嚴重的環境影響.

2.3 微生物降解

微生物降解在去除環境雌激素方面的應用受到廣泛關注,據報道的雌激素降解細菌多為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門,擬桿菌門相對較少[43].其中如表4 所示,紅球菌屬(Rhodococcus sp.)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium sp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas sp.)和叢毛單胞菌屬(Comamonas sp.)等為常見的雌激素降解菌.而近8 年內國內外學者又先后分別從深海沉積物、活性污泥、沙子、土壤、咸水湖、雞糞等環境中分離出枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus sp.)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus sp.)、農桿菌屬(Agromyces sp.)、窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas sp.)、戈登氏菌屬(Gordonia sp.)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.)、交替赤桿菌屬(Altererythrobacter sp.)等新雌激素降解菌屬,分離環境也不再局限于傳統的污泥與土壤,在一些極端環境中分離出新菌株.研究者[44-45]從深海沉積物和人工咸水湖中分離的耐鹽枝芽孢桿菌、交替赤桿菌作為耐鹽株,對于天然雌激素的降解效率高于部分從淡水環境分離的雌激素菌,這一發現表明在某些極端環境中亦存在雌激素,探索新環境將有利于發現更多雌激素降解新菌屬,推動雌激素生物降解的研究進程.

表4 雌激素降解功能細菌Table 4 The estrogens-degrading bacteria

目前對于雌激素降解單菌的研究和報道較多,但在實際應用中單菌的環境適應性仍較低且底物降解譜窄.因此,功能菌群的篩選與構建成為雌激素生物降解的研究熱點,表5 所示為應用功能菌群降解雌激素的最新研究進展.其中前4 組菌群屬于人工復合菌群,復合菌群相對于組成菌群的菌株雌激素降解效率更高.韓施寧[46]研究發現組成BC-2 的2種菌株對于EE2 的降解率皆低于25%,而將二者復合之后的降解率能達到36.4%;Ke 等[47]所構建的菌群BC-3 在2d 之內就將3 種天然雌激素完全去除,菌群中多株菌的協同作用與多種酶的參與,顯著提高了雌激素的降解效率.除了人工復合菌群,從雌激素污染環境中分離的天然菌群,在原位修復方面更具優勢,一方面大部分菌都是屬于土著菌,馴化后投加能減少菌間拮抗的風險,另一方面天然菌群的菌數量遠高于人工菌群,相對來說更加穩定.BC-5 和BC-6 是分別從豬糞污水和活性污泥中分離的天然菌群,Isabelle 等[48]發現BC-5 中高效降解E2 和E1的主要菌屬是甲基桿菌屬(Methylobacterium sp.)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.) 、 假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和分枝桿菌屬(Mycobacterium sp.),Bernardelli 等[49]應用活性污泥反應器降解雌激素,反應器運行30d 后E2、E1 被完全降解,此時污泥中的主要菌屬是假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和硝化螺旋菌屬(Nitrospira sp.),這兩種菌在降解天然雌激素時發揮主要作用,而當E2 和E1 消耗完時,擬桿菌門中的Emticicia sp., Nubsella sp., Sphingobacterium sp.屬以及變形菌門中的 Novosphingobium sp.,Sphingomonas sp., Altererythrobacter sp., Acinetobacter sp.屬成為降解EE2 的主要菌屬.目前對于雌激素降解菌群的報道仍然較少,人工復合菌群或是天然菌群的研究只停留在效果驗證和菌群組成的階段,對于細菌之間的互作關系和機制方面可以成為未來研究的新方向.

表5 雌激素降解菌群Table 5 The estrogen-degrading bacterial consortiums

實際環境中,生物降解很多情況下會面臨極端條件,例如干旱、過酸過堿、高溫等.土著菌存在于任何環境中,游離菌株在不良環境或是土著菌的影響下,其降解效率都會大幅降低.采用適當的固定化材料吸附、包埋微生物,既能避免微生物直接接觸不良環境,載體中的營養物質又能促進生物降解,某些多孔介質還能富集環境中的污染物,提高降解效果.表6 所列舉的是目前報道的雌激素固定化菌劑,大部分較游離菌劑的降解效果都有所提升.Wu等[50]制備的Lysinibacillus sp. GG242 的固定化菌劑是在pH 值為5.0 的條件下進行降解,在該酸性條件下,游離菌劑對E2 降解效果只有38%,但固定化之后降解效果維持在92.3%,說明固定化材料能在菌和實際環境中起到緩沖的作用,維持菌的活性.合成雌激素通常降解時間長、難度大,研究者[39,51]將Pseudomonas putida SJTE-3 和實驗室分離得到的菌群固定,固定后促進了合成雌激素如炔雌醇、己烯雌酚等的降解效果,固定化提高了菌和酶的穩定性并保持其降解的高效性.可見固定化能夠有效促進雌激素生物降解,提高穩定性,制備時有針對性地選擇固定材料,優化固定時間和配比更有利于增強雌激素降解效果.

3 結論與展望

3.1 畜禽糞便中雌激素的降解途徑及分子機制.畜禽糞便中雌激素的降解受到有機質、酸堿度、溫度等因素的影響,而且雌激素的種類繁多,特別是像BPA 和DES 等合成雌激素,對于其降解途徑與具有雌激素效應的產物研究尚少.因此在關心畜禽糞便中天然雌激素環境危害的同時,也應控制合成雌激素的用量和降解過程.近些年,雌激素降解的研究逐步向分子領域過渡,為雌激素微生物降解尋求更科學的理論支撐,如雌激素降解菌的基因調控、功能基因注釋、雌激素降解菌基因組學研究和雌激素降解酶研究等.

3.2 畜禽糞便中雌激素的生態和人群健康風險.采集多種環境中的畜禽糞便樣本,并對所在場地周圍的土壤、徑流、地下水等環境實行多點分析,采用實際測定值進行風險評估,更能科學地反映雌激素生態危害的真實情況.未來研究雌激素在不同環境中遷移的同時,應關注不同種類雌激素的生理毒性,評估糞便-土壤-蔬菜-人體或糞便-水體-水生生物等多條實際遷移途徑所造成的生態風險和對人體健康的影響.

3.3 開發雌激素生物降解新技術.單菌難以適應實際環境,解決實際污染問題,將單菌復配成菌群,一方面菌與菌之間的協同作用能夠提高降解的效果,另一方面針對實際環境中復雜且苛刻的條件,菌群中具有更廣底物譜.功能菌群與合適的材料固定為菌劑,提高雌激素的生物降解效果的同時,也便于工程化量產和使用.

3.4 應用菌劑去除畜禽糞便中雌激素.雌激素降解菌的應用大都在水體或土壤環境中,使用菌劑增強畜禽糞便雌激素降解的研究仍然較少,倘若在畜禽糞便堆肥的同時外加菌劑輔助降解,則能夠在源頭最大程度降低雌激素的環境風險,為畜禽糞便資源化安全利用提供保障.