ABO基因第7外顯子c.539G＆gt;C突變致A2B亞型結(jié)果分析

黃穎，胡思群，溫鄭靜，林甲進(jìn)

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 輸血科，浙江 溫州 325027

人類ABO基因在染色體9q34.1-34.2上，A基因編碼的α-1，3-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)ⅵ?1，3-N-乙酰半乳糖胺加到H抗原的巖藻糖末端，從而產(chǎn)生A抗原活性，當(dāng)該糖基轉(zhuǎn)移酶基因改變時(shí)，就有可能影響其酶活性，導(dǎo)致A血型抗原表達(dá)減弱。近年來從事臨床輸血研究者對(duì)發(fā)現(xiàn)ABO抗原減弱引起ABO血型正反定型不一致的案例進(jìn)行系統(tǒng)分子基因研究，闡明ABO血型抗原減弱的分子機(jī)制[1-3]，雖在ABO血型鑒定中出現(xiàn)頻率不高，但血清學(xué)結(jié)果的表型引起臨床輸血研究者的極大關(guān)注。探討臨床血型鑒定中發(fā)現(xiàn)了4例A2B亞型并進(jìn)行基因測(cè)序，現(xiàn)將結(jié)果分析如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

先證者1，男，9歲，2019年1月7日足外傷住院；先證者2，女，39歲，G4P2，2020年10月22日B超提示：宮內(nèi)單活胎，如孕17+周，因胎盤低置狀態(tài)，孕婦及家屬要求終止妊娠來院檢查。血液常規(guī)發(fā)現(xiàn) Hb 63 g/L、RBC 2.03×1012/L、Hct 0.186，根據(jù)先證者體征和血液檢測(cè)指標(biāo)臨床申請(qǐng)備血；先證者3，女，70歲，2022年12月6日因摔倒致左股骨骨折住院； 先證者4，男，59歲，2023年8月9日因左肩袖損傷住院；在ABO血型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)先證者1、2、3、4正定型凝集強(qiáng)度減弱，先證者2正反定型不一致，血液采集均征得先證者的同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 單克隆抗-A/抗-B血型試劑（批號(hào)20190916）、抗-H試劑（批號(hào)20190114）、抗-A1凝集素（批號(hào)20190820）由上海市血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供；A、B、O型反定型紅細(xì)胞由本科室制備，當(dāng)天使用；核酸DNA提取、人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒（PCR-SSP法）、人類紅細(xì)胞A亞型基因分型試劑盒（PCR-SSP法）由泰州偉禾生物技術(shù)有限公司提供，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。3730基因測(cè)序儀、PCR擴(kuò)增儀由美國ABI公司提供。

1.2.2 血清學(xué)方法 ABO血型鑒定采用試管凝集法，2%～5%紅細(xì)胞分別與單克隆抗-A、抗-B、抗-A1、抗-H試劑反應(yīng)，根據(jù)定型的凝集強(qiáng)度和凝集的狀態(tài)，結(jié)合與抗-A1不凝集者，判定為A亞型紅細(xì)胞。

1.2.3 DNA提取方法 DNA提取采用磁珠法，采用預(yù)先包被二氧化硅超順磁磁珠進(jìn)行DNA結(jié)合與純化：按核酸提取試劑說明書在預(yù)包被試劑反應(yīng)板中加入全血200 μL、蛋白酶K溶液15 μL及核酸釋放劑 60 μL，混勻后將試劑放入核酸提取儀中，等待實(shí)驗(yàn)完成。DNA濃度30 μg/μL、OD值A(chǔ)260/A280的比值為1.6～2.0。

1.2.4ABO基因測(cè)序方法 根據(jù)GENE BANK提供ABO基因序列信息（NG_006669.1）設(shè)計(jì)ABO基因擴(kuò)增引物，測(cè)序引物同擴(kuò)增引物。采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行基因測(cè)序及序列分析，由泰州偉禾生物科技公司提供服務(wù)。

1.3 判定基因型方法

采用Chromas Version 2.6.5軟件閱讀測(cè)序圖譜，并與ABO*A1.01序列（GeneBank序列號(hào)NG006669.1）比較確定突變位點(diǎn)。根據(jù)ISBT網(wǎng)站提供的Names for ABO（ISBT001）blood group alleles v1.1 171023數(shù)據(jù)庫，綜合結(jié)果判定基因型。

2 結(jié)果

2.1 ABO血型血清學(xué)鑒定

先證者1、2、3、4正定型與抗-A凝集減弱；先證者2正反定型不一致，血清中存在抗-A1抗體，正反定型結(jié)果見表1。

表1 4例先證者ABO血型正反定型結(jié)果表

2.2 ABO基因測(cè)序

先證者1、2、3、4ABO基因直接測(cè)序：c.297A＆gt;G、c.467C＆gt;T、c.526C＆gt;G、c.539G＆gt;C、c.657C＆gt;T、c.703G＆gt;A、c.796C＆gt;A、c.803G＆gt;C、c.930G＆gt;A；基因分型為ABO*A2.08/ABO*B.01，與A102序列進(jìn)行比對(duì)，A208在c.467C＆gt;T、c.539G＆gt;C發(fā)生突變，導(dǎo)致多肽鏈P156L和R180P替換，見圖1和圖2。

圖1 c.467C＆gt;T突變

圖2 c.539G＆gt;C突變

3 討論

1900年LANDSTAINER發(fā)現(xiàn)了ABO血型，為臨床安全輸血奠定基礎(chǔ)，在A血型中，最常見是A1和A2表型，A2表型血清學(xué)特點(diǎn)是其紅細(xì)胞與抗-A1凝集素不反應(yīng)，ABO亞型因抗原數(shù)量、組成、轉(zhuǎn)移酶效能不同而有不同，A亞型根據(jù)血清學(xué)特征分為A2、A3、Am、Aw、Ax、Ael、Aend、Aint等[4-6]，其A抗原數(shù)量表達(dá)明顯下降。因此，對(duì)血清學(xué)無法確認(rèn)的亞型，可利用PCR-SSP或基因測(cè)序方式結(jié)合血清學(xué)特點(diǎn)鑒定ABO血型，對(duì)保證臨床安全合理、有效輸血具有重要的臨床意義。

YAMAMOTO[7]首次報(bào)道A2亞型后，至今有更多的A2亞型等位基因被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)Names for ABO（ISBT 001）blood group alleles v1.1 171023分別為A201-220。其中A201、A206、A209、A212、A214、A215、A216均有1061位C缺失，A204可能存在基因重組，而其他等位基因機(jī)理為點(diǎn)突變，這些突變會(huì)導(dǎo)致α-1，3-N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性改變，從而導(dǎo)致A抗原減弱。文獻(xiàn)[8]報(bào)道高加索人A2亞型為1.70%～6.96%、亞洲人A2亞型約0.20%～1.18%、中國上海人A亞型為1.05%，調(diào)查發(fā)現(xiàn)A2亞型以A205為主；A208等位基因首先由許先國[9]等發(fā)現(xiàn)報(bào)道，本研究4例先證者基因測(cè)序結(jié)果對(duì)照基因庫，確認(rèn)為α-1.3-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶基因c.467C＆gt;T和c.539G＆gt;C突變產(chǎn)生A208基因型，引起A抗原表達(dá)減弱，是導(dǎo)致先證者A2B表現(xiàn)型的分子機(jī)制。另外對(duì)于第7外顯子c.467C＆gt;T變異常見A102個(gè)體，在國內(nèi)漢族人群中常見于A變異基因A1.02，其紅細(xì)胞膜上A抗原強(qiáng)度表達(dá)正常，提示A抗原減弱與c.467C＆gt;T變異沒有關(guān)聯(lián)，僅與c.539G＆gt;C相關(guān)[9]。

國內(nèi)外文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道正確檢測(cè)A2（A2B）血型有利于提高器官移植和臨床的輸血安全，在A2B亞型中如存在抗-A1抗體，多數(shù)情況沒有臨床意義，只有在 37 ℃下有反應(yīng)抗-A1抗體才會(huì)具有臨床意義。本研究4例先證者血液檢測(cè)為A2B亞型，先證者1、3、4 ABO正反定型一致，先證者2血清中存在抗-A1抗體，在室溫凝集強(qiáng)度2+，在37 ℃下凝集強(qiáng)度1+，引起紅細(xì)胞血型的正反定型不一致及交叉配血試驗(yàn)的不配合；先證者作為受血者首選同型獻(xiàn)血者血液成分是最佳選擇，由于先證者2血清中存在37 ℃有反應(yīng)抗-A1抗體難以找到相合血液，從現(xiàn)有血清學(xué)特征與分子機(jī)理來看，選擇與其交叉配血無反應(yīng)的相合紅細(xì)胞，如O型懸浮紅細(xì)胞、O型洗滌紅細(xì)胞、B型洗滌紅細(xì)胞，以保證輸血安全。根據(jù)先證者3貧血程度綜合臨床情況給予輸注B型洗滌紅細(xì)胞2個(gè)單位，輸注過程順利無發(fā)生輸血不良反應(yīng)，2022年12月7日復(fù)查血常規(guī)血紅蛋白84 g/L、RBC 2.69×1012/L、Hct 0.244，達(dá)到了預(yù)期的效果，1周后平安出院。