羧化不全骨鈣素與雄性動物生殖關系研究進展

張新科，朱雪丹，陳云，劉松柏，王明明，李思琪，張守全*

(1. 華南農業大學動物科學學院/國家生豬種業工程技術研究中心/廣東省農業動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東 廣州 510642；2. 韶關學院英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005)

骨骼是人類以及哺乳動物最大的器官之一，約占總重的15%。長期以來，骨骼的作用一直被認為僅僅是維持身體運動和保護內臟的器官，是一種靜態的、孤立的器官[1]。近年來，對骨骼更深一步的研究表明了骨骼不再是一種相對靜態的組織，而是一種動態的組織，具有多種內分泌功能，參與調控動物機體多個器官的新陳代謝。其中由成骨細胞分泌的骨鈣素(osteocalcin，OCN)，又被稱為骨γ-羧基谷氨酸蛋白，最早從雞骨和牛骨中被分離出來，是一種在骨形成過程中產生的可分泌非膠原蛋白，部分儲存在骨基質中。骨骼時刻進行著骨重塑過程，正常的骨骼之所以能夠維持一定的骨量就是依賴于破骨細胞與成骨細胞之間的這種動態平衡。骨重塑的調控是復雜的，體內多種激素在骨重塑過程中發揮著不可替代的作用，這些激素都是維持骨骼完整性所必需的。然而，OCN不僅參與骨重塑，而且其活性形式羧化不全骨鈣素(uOCN)在雄性動物生殖能力方面的調控也起著關鍵作用。

OCN是骨骼中含量最高的非膠原蛋白之一。研究表明，OCN含46～50個氨基酸不等，其中人類含有49個氨基酸，小鼠含有46個氨基酸[2]。OCN結構中包含3個谷氨酸殘基，在γ-谷氨?；然傅拇呋?，依靠二氧化碳和維生素K作為主要輔助因子進行羧化[3-4]。由于被羧化了的OCN對羥基磷灰石晶體中的Ca2+更具有親和力，因此成骨細胞分泌的大多數OCN都會被羧化后嵌入骨基質中，所以OCN被認為是骨形成和骨重塑的特異性標志物之一。在骨吸收的過程中，OCN會在骨吸收形成的特定酸性環境下進行脫羧反應，成為一種uOCN，這會降低其對骨的親和力，從而使得uOCN會被釋放進入到血液循環中，最后作用于全身多個器官[5-6]。研究發現，OCN主要是通過其代謝活性形式uOCN發揮多種內分泌功能，uOCN釋放到血液循環后，主要通過與G蛋白偶聯受體6a(Gprc6a)和G蛋白偶聯受體158(Gpr158)結合發揮內分泌功能[7-8]。一方面，uOCN與Gprc6a結合后，胰島B細胞敏感性升高，胰島素分泌增加，在肌肉和脂肪等組織中促進葡萄糖穩態平衡，并促進睪丸間質細胞合成睪酮，調節雄性動物生殖能力；另一方面，uOCN可以穿過血腦屏障并積聚在腦干、丘腦和下丘腦中，與特定神經元中的Gpr158結合以影響各種神經遞質合成和信號傳導，從而在改善認知功能和提升運動協調能力等腦部生長發育過程中發揮著關鍵調控作用。

1 骨重塑與OCN

骨骼是體內一種代謝相當活躍的組織，在體內不斷地被重塑，因此才能夠維持機體正常生命活動所需的骨量。健康的哺乳動物之所以能夠維持恒定的骨量和正常的運動主要就是通過骨重塑的機制不斷進行自我更新來實現的[9-10]。骨重塑是一個終生的過程，參與骨重塑的兩種主要細胞是破骨細胞和成骨細胞。其中，破骨細胞具有吸收舊骨組織的功能，成骨細胞具有形成新骨組織的作用。正常情況下，成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收以一種動態平衡的方式進行工作，這樣才能保證在機體的整個生命過程中維持骨骼的健康和完整性[10-12]。如果這種動態平衡被打破就會導致骨骼疾病，最常見的是骨質疏松癥，這是因為與骨形成的速度相比骨吸收的速度降低了[13]。另外，骨重塑還受到甲狀旁腺激素、生長激素、性激素、糖皮質激素、前列腺素、骨化三醇、降鈣素、骨形態發生蛋白等全身調節因子以及包括多種細胞因子和生長因子在內的局部調節因子共同調控[14]。在哺乳動物的青春期，性腺類固醇激素在動物的骨骼快速增長和維持骨量方面扮演著不可或缺的角色[15]。

在骨重塑的過程中，骨骼的旁分泌和內分泌功能也在時刻進行著。越來越多的研究發現，骨骼不僅僅是一個運動器官，也是一個具有多種內分泌功能的器官，它至少會分泌兩種激素，成纖維細胞生長因子23(FGF23)和OCN[16-17]。其中，FGF23主要通過控制與骨骼健康密切相關的磷酸鹽穩態來調節礦物質代謝，而OCN除了調節骨礦化外，還可調節體內多個靶器官，包括胰腺、肝臟、肌肉、脂肪、睪丸以及中樞和周圍神經系統[18]。另外，研究發現，OCN是在特定的環境下成為未完全羧化的形式uOCN時，才會被釋放到血液，繼而在葡萄糖和能量代謝、雄性動物生殖能力和大腦生長發育中發揮重要調控作用[19]。

2 OCN與uOCN結構

為了更進一步理解OCN與其未完全羧化形式uOCN兩者的功能，研究人員對兩者的結構進行了分析。首先，OCN的本質是蛋白質，而蛋白質的功能是由其結構決定的，所以OCN與uOCN兩種不同的結構導致了兩者不同的功能。OCN的結構由3個多肽鏈組成，包括1條N-末端多肽鏈、1條C-末端多肽鏈和一條中心多肽鏈，其中C-末端多肽鏈包含有與羥基磷灰石晶體中的Ca2+結合的位點。以人為例，人體內的OCN先被合成為具有98個殘基的OCN前體，其中包括1條含有23個殘基的信號多肽鏈(在翻譯過程中易位進入內質網后被切割)、含26個殘基的前體多肽鏈(包括γ-谷氨?；然傅淖R別位點)和49個殘基的成熟多肽鏈。經過翻譯修飾后，大多數OCN被完全羧基化，含有3個谷氨酰胺殘基，然后與羥基磷灰石晶體中的Ca2+結合沉積到骨細胞外基質中。進一步研究發現，OCN是由3個α-螺旋、2個β-折疊和a-β片組成，形成一個疏水核心和緊密的球狀結構。螺旋α1(H1)和螺旋α2(H2)通過從Asn26到Cys29的a-β彎連接，形成“V”形排列，并由Cys23和Cys29之間的二硫鍵連接。螺旋α3(H3)排列對齊以平分H1和H2的“V”形，這3個α-螺旋形成了一個緊密的疏水核心和一個以H1為中心的帶負電的表面，與羥基磷灰石晶體中Ca2+結合有關的3個谷氨酰胺殘基都位于H1的同一表面[20]。但由于在特定環境中γ-谷氨?；然该擊然蚓S生素K缺乏活性不足從而導致部分或全部的羧化位點未被修飾成谷氨酰胺殘基，就成為了只含有0～2個谷氨酰基殘基的uOCN[21]。正是由于uOCN在羧化過程中的比OCN少了谷氨酰胺殘基結構，因此導致其不易于與羥基磷灰石晶體中的Ca2+結合，因而當其被釋放到血液循環中時便能發揮其一系列的內分泌功能[22]?？偟膩碚f，OCN與uOCN在結構上的差異主要是羧化狀態的不同，uOCN在結構上缺少一些谷氨酰胺殘基從而降低與羥基磷灰石晶體中Ca2+結合的可能性，因此其可以在體內發揮一系列的內分泌功能。

3 uOCN在提升雄性動物生殖能力方面的功能

uOCN是一種內分泌激素，在調節能量代謝、雄性動物生殖能力和大腦發育等方面都發揮著十分重要的作用。其中，uOCN對雄性動物生殖能力的提升這一新功能的發現更進一步證明了骨骼是一個具有多種內分泌功能的器官。睪酮是一種類固醇激素，是雄性動物體內一種重要的雄性激素，也被稱為睪丸激素，它主要由睪丸間質細胞合成并分泌，它有許多功能，例如生殖細胞的存活和精子的發生等。研究表明，睪酮具有支持生殖細胞成熟并防止其過早凋亡的功能，體內睪酮水平的下降提示雄性動物生殖器官異?；蛩ダ蟍23]。雄性動物體內睪酮水平的平衡能夠促進睪丸和附睪的正常分泌，維持精子健康的生成和發育，因此維持雄性動物體內一定的睪酮水平對雄性動物生殖能力的提升有一定幫助。

隨著研究人員不斷研究，uOCN作為一種新型雄性動物生殖能力的調節劑出現在研究者的視線中。2011年，為了探究uOCN對雄性動物生殖能力作用的具體表現，Oury等[19]研究表明，敲除了uOCN基因的雄性小鼠會出現生殖能力明顯下降的表現，如精子數目減少，睪丸、附睪和精囊重量下降。此外，進一步對試驗小鼠體內血清uOCN含量進行分析發現敲除了OCN基因的雄性小鼠血清中uOCN水平也顯著降低，說明由成骨細胞分泌的uOCN可能通過某種機制影響了精子的生成，進而調節雄性動物生殖能力。近年來，uOCN作為雄性動物體內睪酮產生的調節劑的功能在人身上也得到了證明。其中一項研究表明，對比健康人群和骨骼疾病患者的體內uOCN水平和骨轉換速率發現，其與體內睪酮循環水平呈顯著相關性[24]。此外，Kirmani等[25]的研究也表明，男性青春期中期的血清uOCN水平和睪酮水平之間存在顯著關聯。在人類臨床研究中發現，中年肥胖男性的體內血清總OCN水平與體內睪酮水平呈顯著正相關[26]。經過進一步探究發現，uOCN通過作用于睪丸間質細胞顯著提升了睪酮的分泌量，而成骨細胞的這種內分泌功能僅限于雄激素睪酮的產生，而不影響睪丸或卵巢分泌雌二醇和孕酮。此外，成骨細胞的條件培養基以及外源uOCN均可增加睪丸間質細胞中睪酮的合成分泌，但卵巢外植體分泌的雌二醇和孕酮水平似乎沒有受到影響[19]。目前這些證據都表明了成骨細胞對生殖的內分泌功能僅對睪酮的合成分泌起作用。2014年，Oury等[27]研究又發現，睪丸間質細胞中的Gprc6a受體可以與uOCN進行結合，并向下游的轉錄效應因子提供相應的信號傳遞，以此來提升睪酮的合成速率。因此，雄性動物體內的uOCN水平與體內的睪酮水平是息息相關的，uOCN可以促進雄性動物體內睪酮的生成。眾所周知，性腺對骨重塑具有調控作用，例如雌激素和睪酮對動物骨骼的不斷更新生長以及骨量的維持都有相當重要的影響，但反過來關于從骨骼到性腺的“反向調節信號”卻很少報道。骨骼也可反過來通過uOCN發揮其內分泌功能來影響雄性動物的生殖功能，這一發現為研究人員對uOCN功能的研究打開了一個嶄新的思路。

4 uOCN提升雄性動物生殖能力的作用機制

4.1 uOCN與胰島素之間相互調節促進睪酮產生

uOCN對雄性動物生殖能力的影響讓研究者們對這一相關機制產生了興趣，在對uOCN是如何通過促進睪丸間質細胞產生睪酮的一系列研究中，意外發現在成骨細胞中設法增強胰島素信號也能提高雄性小鼠的生殖能力，這表明了成骨細胞中胰島素信號靶向調節雄性動物生殖能力的可能性。后續一系列的研究也驗證了這一觀點，即破骨細胞的活性可以通過胰島素刺激骨轉換來增強，這樣胰島素充當OCN激活的媒介，繼而提升了雄性動物的生殖能力，形成“胰島素-骨-性激素-骨”的反饋環路，其中，OCN在該環路的運轉過程中扮演著多系統靶向調控的角色[28]。這也表明破骨細胞骨吸收是通過增加OCN生物活性來提升正常雄性動物生殖能力。進一步研究其機制發現，OCN具有一種不同尋常的激活方式，即依靠成骨細胞和破骨細胞之間的相互作用進行激活。成骨細胞產生并分泌OCN存儲在細胞外骨基質(ECM)中，然后破骨細胞的活性在ECM中產生吸收腔，誘導低pH(4.5)的環境，通過促進其脫羧反應來生物激活OCN[29]。胰島素信號不僅能夠調節成骨細胞對OCN進行脫羧激活成uOCN，胰島素信號還能抑制成骨細胞中編碼骨保護素(OPG)的基因的表達，從而阻礙破骨細胞的分化[30]。G蛋白偶聯受體Gprc6a作為介導睪酮合成的受體，它在睪丸間質細胞中表達后與uOCN結合之后，有利于促進環磷酸腺苷cAMP的產生，從而激活轉錄因子CREB(cAMP反應元件結合)，并使CREB與睪酮生物合成必需酶的基因啟動子區域結合，增加睪酮生物合成必需酶的轉錄。因此，被激活的CREB可以對幾種編碼睪酮生物合成必需酶的轉錄表達進行調控進而調控睪酮的合成，例如StAR，Cyp11a，3β-HSD和cyp17。其中，類固醇急性調節蛋白(StAR)負責把膽固醇轉運到啟動類固醇生物合成的線粒體中，而Cyp11a負責編碼膽固醇側鏈裂解酶(P450scc)，該酶是催化反應第一步和限速步驟的關鍵酶，可以把膽固醇轉化為孕烯醇酮，最后由3β-HSD和Cyp17負責編碼將孕烯醇酮轉化為睪酮過程中所必需的兩種酶[31-33]。因此，胰島素可以通過刺激成骨細胞與破骨細胞來促進OCN的產生，并通過脫羧使其中一部分成為uOCN進一步發揮刺激睪丸間質細胞產生分泌睪酮的作用。同時，OCN也扮演著骨代謝和能量代謝之間橋梁的角色，uOCN可以促進胰島素的分泌[34]。有研究表明OCN可以改善由脂毒性誘導的胰島β細胞型胰島素分泌障礙[35]。OCN與胰島素之間的這種相互調節作用也為以后的相關研究指明了方向。

4.2 uOCN通過維生素D調節途徑介導睪酮產生

uOCN與維生素D的關聯也對雄性生殖能力有一定的影響。研究發現，維生素D主要是通過其活性形式1，25(OH)2D3促進睪丸間質細胞合成釋放睪酮，而1，25(OH)2D3缺乏與年輕雄性動物的睪酮/雌二醇比例較低有關[36]。另外，動物試驗研究通過飼喂缺乏維生素D的飼糧，發現雄性小鼠的睪丸重量和精子質量都顯著降低，睪丸生殖細胞受到抑制，血清睪酮水平降低[37]。維生素D屬于類固醇激素，是骨礦化和體內鈣磷代謝穩態的主要調節因子。其中，維生素D3是維生素D的一種主要形式。維生素D3進入體內后與維生素D結合蛋白結合先在肝臟經由25-羥化酶Cyp2r1轉化為體內主要存在形式25(OH)D3，然后再經過腎臟由1α-羥化酶Cyp27b1轉化為活性形式1α，25(OH)2D3到靶器官發揮作用。de Toni[38]及其同事發現，利用睪丸間質細胞系，在與Gprc6a結合后，uOCN可以調節Cyp2r1的表達，有利于促進維生素D的羥基化。Cyp2r1作為編碼維生素D轉化為其活性形式1，25(OH)2D3所必需的一個關鍵酶，這表明uOCN對睪丸生成睪酮功能的促進作用可能是通過調節維生素D調節途徑介導的，這也為uOCN在睪丸中的調節作用增加了另一個新的維度[39]。

4.3 uOCN通過下丘腦-垂體-性腺軸促進睪酮產生

下丘腦是中樞神經系統(CNS)的重要組成部分，主要通過其在垂體前葉和自主神經系統上的活動來調節神經內分泌功能。目前，有研究發現uOCN通過其受體在CNS中的直接調節功能，包括其在大腦正常發育過程中以及在認知功能障礙和帕金森綜合征等病理狀況下的有益作用[40-42]。關于uOCN通過下丘腦-垂體-性腺軸對雄性動物生殖能力影響的研究，研究人員也有不同程度的發現。Pi等[43]在雄性小鼠體內觀察到Gprc6a不僅在睪丸間質細胞中表達，而且還在下丘腦和垂體前葉中表達。Piaggi等[44]發現中樞OCN受體Gpr158也在下丘腦和垂體中大量表達。這說明uOCN也可能通過與下丘腦和垂體中的Gprc6a或其受體Gpr158結合從而促進睪酮的產生。此外，據相關研究報道，人類體內uOCN受體的功能喪失突變與由高促性腺激素引起的性腺功能減退癥有關，這表明uOCN可能是正常垂體-性腺軸發揮其功能所必需的物質[45]。uOCN可以穿過血腦屏障與下丘腦和垂體中的相關受體結合，然后通過對促性腺激素釋放激素(GnRH)神經元和γ-氨基丁酸(GABA)能神經元的調節發揮作用[46]。眾所周知，睪丸功能的調節通常歸因于下丘腦-垂體-性腺軸。根據這種內分泌途徑，下丘腦釋放GnRH刺激腺垂體產生兩種促性腺激素，即卵泡刺激素(FSH)和促黃體激素(LH)。隨后，FSH和LH通過作用于睪丸分別刺激精子發生和睪酮的產生，而睪酮反過來又抑制GnRH和促性腺激素的釋放，具有負反饋作用[47]。uOCN通過下丘腦-垂體-性腺軸對雄性動物生殖能力的調控是復雜的過程。LH是一種垂體激素，它是睪丸間質細胞合成睪酮的主要調節因子。有研究表明，uOCN可以調節GnRH和LH的分泌頻率，從而調節睪酮的合成分泌[48]。uOCN與睪丸間質細胞中的Gprc6a結合后，可以促進環磷酸腺苷cAMP的產生，從而激活轉錄因子CREB(cAMP反應元件結合)，并使CREB與睪酮生物合成必需酶的基因啟動子區域結合，增加睪酮生物合成必需酶的轉錄。因此，被激活的CREB可以對幾種編碼睪酮生物合成必需酶的轉錄表達進行調控進而調控睪酮的合成，例如StAR，Cyp11a，3β-HSD和cyp17。

5 結語

OCN不僅參與骨重塑，而且在多種生理過程中起著關鍵作用。OCN具有提升雄性動物生殖能力的作用，主要是通過其代謝活性形式uOCN來發揮作用。uOCN不易與羥基磷灰石晶體結合，可以被釋放到血液循環到達靶器官。uOCN可以通過胰島素信號增強、維生素D介導途徑和下丘腦-垂體-性腺軸與其特定的受體結合促進睪酮產生。總之，uOCN對雄性動物生殖能力具有一定促進作用，但具體作用機制有待更深一步進行研究。