某規(guī)模化牧場致犢牛腹瀉的大腸桿菌分離鑒定及耐藥性檢測

曹 芳，魏 勇，吳 憂，趙鵬飛，陳釗銘，任靜靜，齊亞銀

1 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003

2 新疆天潤科技股份有限公司，新疆烏魯木齊 830063

0 引言

犢牛腹瀉俗稱犢牛拉稀，一年四季均可發(fā)生，是犢牛常發(fā)的一種胃腸問題。多發(fā)于2 周齡犢牛，這個階段的牛抵抗力差，容易受感染。犢牛患病后，如不及時治療，其死亡率升高，患腹瀉病的牛表現(xiàn)為便稀、嘔吐、脫水等癥狀，治療不當(dāng)會影響生長。犢牛腹瀉的發(fā)生主要由多種因素引起，國內(nèi)外研究結(jié)果證實，傳染性犢牛腹瀉主要由大腸桿菌、沙門氏菌、球蟲、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒等病原導(dǎo)致[1～4]。其中，大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的最主要病原菌，病死率40%～50%[5]，是一種可誘發(fā)腸內(nèi)和腸外疾病的病原體[6，7]。目前臨床對大腸桿菌感染所致的犢牛腹瀉，一般采取抗菌藥治療，但抗生素長期、不規(guī)范使用，致病菌容易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果下降甚至無效。

為了解新疆某規(guī)模化牧場犢牛腹瀉流行情況以及大腸桿菌感染情況，找到合適的治療措施，本試驗從石河子地區(qū)某規(guī)模化牧場采集腹瀉犢牛糞便樣品，進行病原菌分離鑒定及藥敏試驗，并結(jié)合牧場實際情況，提出合理應(yīng)對措施，為石河子地區(qū)犢牛腹瀉的防治及犢牛健康養(yǎng)殖方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例來源

石河子某規(guī)模化牧場腹瀉犢牛糞便樣品。

1.2 試驗儀器設(shè)備

光學(xué)顯微鏡（Olympus公司）、恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、電泳儀（北京市六一儀器廠）、PCR擴增儀（Techne公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Biorad公司）。

1.3 主要試劑

LB液體培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司），鏈霉素、青霉素、氨芐西林、四環(huán)素、頭孢噻肟、萬古霉素藥敏紙片（杭州濱和微生物試劑有限公司），細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.4 臨床診斷與采樣

觀察犢牛肛門及糞便，注意犢牛的精神狀態(tài)、被毛、采食情況等。清晨飼喂前無菌采集腹瀉嚴重犢牛的糞便樣品15份，置于5 mL無菌離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病原菌分離純化及DNA 提取

取糞便樣品無菌接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。取2 mL菌液按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟，提取細菌總DNA，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩氖Ｓ嗑褐袩o菌劃線接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h。挑取伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中典型單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)；然后，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。繼續(xù)挑取典型單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)，后染色鏡檢。

1.6 PCR 鑒定

設(shè)計大腸桿菌特異性引物，將上述DNA進行PCR擴增。引物序列見表1，反應(yīng)體系為25 μL：2× Taq Plus Master mix Ⅱ 10 μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O 12 μL，cDNA模板2 uL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，30 個循環(huán)，72 ℃延伸50 s，72 ℃終延伸10 min。

表1 相關(guān)細菌引物序列

PCR擴增反應(yīng)完成后，進行凝膠電泳試驗，在凝膠成像儀下觀察，若出現(xiàn)與引物相應(yīng)大小條帶則為目的條帶。

1.7 藥敏試驗

取營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)后的菌液，用移液槍吸取100 μL均勻涂抹到整個麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上[8]，貼藥敏片，37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，判定結(jié)果參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）藥敏紙片擴散法法規(guī)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床診斷結(jié)果

該牧場犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀，糞便呈黃色，稀狀；被毛雜亂無光澤；腹瀉犢牛食欲下降，腹部收縮，精神不濟（圖1）。

圖1 腹瀉犢牛的被毛和糞便情況

2.2 病原菌分離鑒定及純化

針對采集的腹瀉犢牛糞便樣品，增菌培養(yǎng)后提取D N A 進行特異性引物P C R 擴增，鑒定結(jié)果顯示，1 5 份樣品中共有1 2 份感染大腸桿菌，感染率為8 0%，P C R 擴增結(jié)果如圖2 所示，可觀察到287 bp（大腸桿菌）條帶，大小與預(yù)期符合。

圖2 PCR 鑒定結(jié)果

將菌液接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基上生長出紫黑色并帶有綠色金屬光澤菌落（圖3a）。挑取典型單菌落增菌接種于麥康凱瓊脂平板中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)麥康凱培養(yǎng)基平板上長出圓形、金屬紅色光澤菌落（圖3b）。菌落分離純化后，鏡檢結(jié)果顯示該菌為革蘭氏陰性桿菌，其形態(tài)與大腸桿菌一致（圖3c）。

圖3 接種于鑒別培養(yǎng)基后的形態(tài)結(jié)果和菌液鏡檢結(jié)果

經(jīng)P C R 結(jié)果、培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定結(jié)果以及鏡檢結(jié)果，可判定糞便樣品中致病菌之一為大腸桿菌。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示，1 2 份大腸桿菌糞便樣品中分理得到的1 3 株大腸桿菌對鏈霉素耐藥率最高為46.15%（6/13），對青霉素、氨芐西林耐藥率為3 8.4 6%（5/1 3），且敏感菌株多為中低敏或低敏感；對四環(huán)素敏感性為76.92%（10/13），13 株菌株對頭孢噻肟和萬古霉素敏感性最高，為84.62%（11/13）。通過藥敏試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)分離菌株多出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，詳細數(shù)據(jù)見表2。

表2 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

3 討論

引發(fā)犢牛腹瀉的大腸桿菌病在全國乃至世界各地廣泛流行，給奶牛養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟損失[2]。目前，對大腸桿菌導(dǎo)致犢牛腹瀉的治療，多以抗生素為主。但隨著抗生素的廣泛、長期使用，細菌耐藥性問題日趨嚴重[10]。細菌耐藥性不僅對臨床治療有很大影響[11]，也給動物食品安全帶來潛在風(fēng)險，對養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展帶來極大危害[12]。犢牛出生后由于自身機能較差，免疫力低下，易受環(huán)境、飼養(yǎng)管理、應(yīng)激等因素[13]的影響，導(dǎo)致腹瀉。

本試驗對1 5 份犢牛腹瀉病料進行病原菌鑒定，除3 份為其他病原菌感染外，1 2 份是由大腸桿菌感染，大腸桿菌分離率為8 0%，說明該牧場犢牛腹瀉多為大腸桿菌感染所致。對1 3 株大腸桿菌進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，大多數(shù)大腸桿菌出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，1 3 株大腸桿菌對頭孢噻肟及萬古霉素較敏感，對四環(huán)素敏感度也較高，建議該牧場根據(jù)分離得到的病原菌及耐藥結(jié)果采取合理治療措施。

通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該牧場存在犢牛島無遮擋，且部分犢牛島未安裝蓋子；犢牛出生后疫苗接種落實不到位；犢牛圈舍環(huán)境臟、亂、差，糞便無人清理，墊料更換不及時；犢牛料不新鮮；犢牛發(fā)病初期未能及時察覺、未能合理使用有效藥物治療等問題。相關(guān)人員應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，及時更換墊草、清理糞便，及時消毒圈舍。對新生犢牛及時接種疫苗，制定嚴格的免疫保健方案。關(guān)注犢牛生長及身體狀況，一旦發(fā)現(xiàn)身體異常的犢牛，應(yīng)盡快檢測。若確診為犢牛腹瀉，應(yīng)及時確定引起腹瀉的病原菌，采取應(yīng)對治療措施，按照嚴重程度使用乳酶生（乳酸菌片）調(diào)節(jié)腸道菌群，灌服萬金水，清理胃腸道有害致病菌。后期采用慶大霉素灌服，必要時及時補液。

4 總結(jié)

犢牛腹瀉是腸道消化功能障礙，主要由犢牛自身因素、環(huán)境條件、病原微生物等引起。牧場應(yīng)加強管理，增強飼養(yǎng)人員的責(zé)任心，隨時觀察犢牛精神狀態(tài)，一旦出現(xiàn)腹瀉和脫水癥狀，立即查找原因，采取有效措施救治，盡量降低腹瀉對犢牛生長發(fā)育帶來的影響，同時合理使用抗生素，避免出現(xiàn)細菌耐藥情況。