含吡啶類腈類醫(yī)藥中間體廢鹽對海洋青鳉魚胚胎的毒性效應(yīng)

李乾永 梁 川 馬正茁 孫哲誠 劉懷淇 徐炎華 劉志英

(南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京 211816)

自黨的十八大報告將生態(tài)文明建設(shè)納入五位一體總體布局以來,環(huán)保管理日益嚴格,各地逐步推行工業(yè)廢水零排放政策,常采用多效蒸發(fā)法導(dǎo)致大量工業(yè)廢鹽產(chǎn)生[1]。工業(yè)廢鹽涉及農(nóng)藥、制藥、染料等多行業(yè),具有種類繁多、產(chǎn)生量大、成分復(fù)雜、毒性強、處理成本高、環(huán)境危害大等特點,不能直接作為工業(yè)原料利用[2-4]。廢鹽中的鹵代烴類、苯系物類等有機物,已被多國列為優(yōu)先污染物[5]。同時,廢鹽易溶解會伴隨雨水流失,導(dǎo)致周圍環(huán)境被進一步污染[6-8]。2019年中國可記錄的廢鹽年產(chǎn)量為2.1×107t[9],對應(yīng)處理處置市場規(guī)模約5.6×1010元。在《危險廢物填埋污染控制標準》(GB 18598—2019)[10]實施后,工業(yè)廢鹽處理技術(shù)中安全填埋被主要采用。然而,填埋存在潛在的環(huán)境和安全風(fēng)險,而交由固廢處置中心處理則需高昂成本[11]。排海處理則可降低廢鹽處理成本并節(jié)約土地資源,2021年《危險廢物環(huán)境管理指南 化工廢鹽》[12]中明確了廢鹽無害化處理后排海的要求。但由于缺乏工業(yè)廢鹽排海的生態(tài)環(huán)境影響研究,國內(nèi)對此存在顧慮。研究缺失導(dǎo)致難以評估環(huán)境風(fēng)險,也無法推進排海項目。并且,工業(yè)污染物成分復(fù)雜多變,難以通過單個或多個污染物進行聯(lián)合模擬,目前主要以工藝生產(chǎn)流程為區(qū)分。

在海洋生態(tài)毒理學(xué)研究中,選擇合適的受試生物對于準確評估毒性至關(guān)重要。海洋青鳉魚(Oryziasmelastigma)作為海洋生態(tài)毒理學(xué)研究的優(yōu)秀模式生物,已被國際生命科學(xué)學(xué)會(ILSI)與健康和環(huán)境科學(xué)研究所(HESI)認定為毒理學(xué)研究的重要工具[13]。相對于其他常用的模式生物,如斑馬魚、孔雀魚、牙鲆、星點東方鲀、半滑舌鰨等,海洋青鳉魚具有環(huán)境適應(yīng)性好,可適應(yīng)鹽度為0～35‰、溫度為0～40 ℃的水體;體型較小,易于實驗室培養(yǎng);產(chǎn)卵量大,魚卵體型較大且透明,便于觀察;世代周期較短,2～3個月可由胚胎發(fā)育為成魚,且雌、雄魚易辨別等優(yōu)勢特點[14]3-5,[15]11,[16],[17]106349。海洋青鳉魚作為新型優(yōu)秀的海洋生態(tài)毒理學(xué)研究模式生物,可用于評估外源性化合物的急性或發(fā)育毒性。研究內(nèi)容包括:形態(tài)學(xué)變化[18-20],如胚胎大小和心率,仔魚體重、體長、性別比和畸形率等;運動學(xué)變化[21]113843,如游泳頻率和眼動頻率等;再結(jié)合生化指標和病理學(xué)特征,如性別變化[22]、器官變化[23]、細胞衰亡[24]125537、腸道菌群[25]152945、酶活性和相關(guān)化合物含量[26]等;最后,通過組學(xué)分析如轉(zhuǎn)錄組學(xué)[17]106349,[25]152945、蛋白質(zhì)組學(xué)[27]和代謝組學(xué)[28]等差異表達來探究外源性化合物的毒性及其深層次的機制。研究結(jié)果可為相關(guān)外源化合物的環(huán)境風(fēng)險評估和管理提供有力的科學(xué)依據(jù)。

本研究基于實際工業(yè)生產(chǎn)中的問題,選用醫(yī)藥中間體副產(chǎn)廢鹽及其處理后的除雜鹽為實驗樣品,研究其對海洋青鳉魚胚胎生長、發(fā)育以及酶活性的影響,旨在評估復(fù)合污染物廢鹽在海洋生態(tài)環(huán)境中的風(fēng)險,并為廢鹽排海工程提供實驗數(shù)據(jù)與理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與受試生物準備

實驗使用的廢鹽來源于某醫(yī)藥中間體企業(yè)。廢鹽原鹽經(jīng)過熱化學(xué)處理、冷卻回溶、過濾除雜,最后蒸發(fā)結(jié)晶的方式獲得除雜鹽。

海洋青鳉魚取自廈門大學(xué),已在實驗室穩(wěn)定培育了兩代以上。實驗前按雌雄比1.2∶1.0挑選個體健康、無明顯畸形的6月齡成魚。飼養(yǎng)條件:實驗用海鹽(法國紅十字小丑鹽,Instant Ocean)按說明溶于經(jīng)砂芯過濾后的超純水中,鹽度為(30±1)‰,溫度為(28±2) ℃,溶解氧>6.0 mg/L,光暗周期為14 h∶10 h,成魚喂食豐年蝦幼蟲,每日3次。實驗前晚清空缸中魚卵,次日在光照開始、成魚產(chǎn)卵的3 h內(nèi)收集所有胚胎,通過顯微鏡觀察,篩選出已受精的胚胎。

實驗試劑盒:總蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和溶菌酶(LZM)測定試劑盒。

實驗儀器:體視顯微鏡(SZ61-TR,Olympus)、紫外可見光分光光度計(UV-2600i,Shimadzu)、光照培養(yǎng)箱(HPG-400BX)、手持高速勻漿器(F6/10)、高速冷凍離心機(GL-20G-II)、細胞培養(yǎng)板等。

1.2 廢鹽分析

對廢鹽進行X射線衍射(XRD)、電感耦合等離子體(ICP)和總有機碳(TOC)分析,廢鹽的硫酸根、氯化鈉、鈣鎂離子、水不溶物和水分含量按《制鹽工業(yè)通用試驗方法》(GB/T 13025.x—2012)進行測定。

1.3 急性毒性實驗

采用經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)魚類胚胎急性水生毒性實驗設(shè)計。實驗從卵子受精后盡早開始,暴露時間為96 h,最終得出96 h半數(shù)致死濃度(LC50)。設(shè)置廢鹽質(zhì)量濃度為0(對照組)、6、12、18、24、30 g/L,每個濃度設(shè)3個生物學(xué)平行。在6孔板中進行暴露,每孔加入10枚胚胎與15 mL對應(yīng)暴露溶液,采用半靜態(tài)暴露方式,每日換水2/3。每日觀察胚胎發(fā)育及生命活動情況,統(tǒng)計胚胎死亡數(shù)并清除死亡胚胎。實驗置于光照培養(yǎng)箱中進行,胚胎孵化的環(huán)境參數(shù)與成魚一致。96 h LC50通過概率單位法計算。

在進行所有暴露實驗前,將廢鹽暴露溶液按照相應(yīng)濃度配置,并將所有暴露溶液補充海鹽至鹽度為(30±1)‰。

1.4 發(fā)育毒性實驗

根據(jù)急性毒性實驗結(jié)果,設(shè)置廢鹽質(zhì)量濃度為0(對照組)、2、4、6、10、14 g/L,同時設(shè)置除雜鹽質(zhì)量濃度為30 g/L。使用培養(yǎng)皿(直徑10 cm)作為暴露容器,每個培養(yǎng)皿中加入60枚胚胎,每組濃度重復(fù)3次。實驗環(huán)境參數(shù)遵循前文描述。每日記錄胚胎死亡數(shù)和孵化數(shù),觀察胚胎發(fā)育情況。在5、8受精后天數(shù)(dpf)時從每個培養(yǎng)皿中隨機挑選10枚胚胎,使用體視顯微鏡測定心率。測定方法為顯微鏡下記錄30次心跳所需時間并換算成每分鐘心率,每個胚胎重復(fù)3次。

1.5 系統(tǒng)損傷實驗

設(shè)置廢鹽質(zhì)量濃度為0(對照組)、2、6、14 g/L和除雜鹽質(zhì)量濃度30 g/L進行實驗。在5、8 dpf時,取出所需數(shù)量的胚胎,使用超純水將胚胎表面沖洗干凈后按照對應(yīng)試劑盒說明書進行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件中的Probit模塊進行急性毒性分析。對于發(fā)育毒性和系統(tǒng)損傷實驗數(shù)據(jù),在確保數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性的前提下,采用單因素方差分析法和最小顯著性檢驗法(LSD)進行組間差異顯著性分析,結(jié)果以平均值±標準差的形式表示。分析采用95%(α=0.05)可信限,P<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 廢鹽成分分析及暴露溶液TOC分析

對廢鹽和除雜鹽進行XRD、ICP、TOC和純度分析,結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明廢鹽和除雜鹽主要成分為NaCl,除Al(396.152 nm)外無其他重金屬。廢鹽純度不符合GB/T 5462—2015[29]中工業(yè)干鹽二級標準。

表1 成分分析1)

廢鹽溶解過濾后進行氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)分析,結(jié)果表明廢鹽中有機物主要為吡啶類、腈類有機物。實驗所用暴露溶液的TOC結(jié)果如圖1所示。由圖1可見,TOC與廢鹽濃度呈現(xiàn)顯著濃度—劑量關(guān)系。

注:含有相同字母表示處理間差異不顯著(P>0.05),反之則差異顯著(P<0.05)。后圖同。

2.2 急性毒性實驗結(jié)果

如圖2所示,胚胎死亡的主要表現(xiàn)為胚胎凝固變白、無心跳和孵化失敗。在96 h的急性毒性實驗中,對照組死亡率小于10%,而當廢鹽為30 g/L時,死亡率大于90%,符合急性毒性實驗要求。通過擬合lgC(C為廢鹽質(zhì)量濃度,g/L)和96 h死亡率之間的關(guān)系曲線(見圖3),計算得出廢鹽對海洋青鳉魚胚胎的96 h LC50為13.94 g/L。

圖2 不同時期的健康胚胎與死亡胚胎

圖3 胚胎死亡率和lgC的關(guān)系

2.3 發(fā)育毒性實驗結(jié)果

2.3.1 死亡率

不同鹽濃度下海洋青鳉魚在20 d持續(xù)暴露期間的累計死亡率和最終死亡率如圖4所示。胚胎死亡率隨著廢鹽濃度的升高呈顯著遞增趨勢。除雜鹽組的胚胎死亡率為(21.18±1.70)%,顯著高于對照組的(12.50±2.16)%(P<0.05),又顯著低于廢鹽實驗組(P<0.05)。胚胎死亡的發(fā)生時間隨廢鹽濃度的上升而提前,在高濃度廢鹽溶液(10、14 g/L)暴露下,胚胎死亡主要集中在3～6 dpf,這是因為處于胚胎時期的海洋青鳉魚解毒功能器官尚未發(fā)育完全,對外界環(huán)境的抵抗力較弱,在面對外界環(huán)境的不良脅迫時,易造成個體死亡[15]44。而在較低濃度時,由于胚胎與廢鹽接觸時間較長,經(jīng)受的環(huán)境脅迫逐漸累計,胚胎死亡與自然孵化出現(xiàn)的時期相似(7～12 dpf),但死亡率顯著上升。未經(jīng)處理的廢鹽成分復(fù)雜、毒性較強,而在經(jīng)過處理后的除雜鹽暴露的海洋青鳉魚胚胎死亡率大大降低,這與處理后除雜鹽中TOC的下降密切相關(guān)。

圖4 不同鹽濃度暴露下胚胎的累計死亡率和最終死亡率

2.3.2 孵化率和孵化時間

不同鹽濃度下海洋青鳉魚持續(xù)暴露20 d的孵化率如圖5(a)所示。與對照組孵化率相比,廢鹽實驗組和除雜鹽實驗組的胚胎孵化率均存在顯著性差異(P<0.05)。除雜鹽實驗組孵化率為(78.82±2.17)%,僅低于對照組孵化率的(87.50±2.76)%。

圖5 不同鹽濃度暴露下胚胎的孵化率和孵化時間

不同鹽濃度下海洋青鳉魚的孵化時間如圖5(b)所示,低濃度廢鹽(4、6 g/L)實驗組孵化時間顯著高于對照組(P<0.05),而10 g/L的廢鹽顯著降低了胚胎的孵化時間(14 g/L時胚胎全部死亡,故無孵化時間)。這種胚胎受到外界環(huán)境刺激后減少孵化時間的現(xiàn)象在其他的研究中也有報道[30],這與環(huán)境污染物介導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)使海洋青鳉魚胚胎的抗氧化系統(tǒng)失衡有關(guān)[31]106-107。

廢鹽成分中的吡啶類和腈類有機物的聯(lián)合作用對海洋青鳉魚胚胎的生長發(fā)育產(chǎn)生了顯著影響。當廢鹽質(zhì)量濃度為2、4、6 g/L時,孵化時間持續(xù)延長,結(jié)合廢鹽成分推測為廢鹽中的大量污染物附著于胚胎表面(見圖6),抑制了胚胎對外界的營養(yǎng)吸收效率。而當廢鹽質(zhì)量濃度為10、14 g/L時孵化時間縮短,甚至在一定時間后全部死亡。推測是高濃度廢鹽的毒性迫使胚胎通過提前孵化而盡可能保證生存的高效繁殖方式有關(guān),這與倪曉敏[14]91-93進行的六價鉻長期暴露實驗結(jié)論一致。同時黃偉等[32]發(fā)現(xiàn),重金屬引起孵化腺功能變化會造成孵化過程可能延長或縮短。除雜鹽實驗組中胚胎孵化時間縮短,可能是因為在胚胎生長發(fā)育、器官形成和機體系統(tǒng)平衡等生命過程中微量元素具有極其重要的生物學(xué)功能[33]。然而,除雜鹽組鹽度完全通過除雜鹽進行調(diào)節(jié),未添加人工海鹽,因此缺少了胚胎生命初期中所需要的微量元素和其他金屬元素。

圖6 表面附著污染物的胚胎

2.3.3 心 率

不同鹽濃度暴露下的海洋青鳉魚胚胎心率如圖7所示。5 dpf時,除了6、10 g/L外的實驗組心率均顯著低于對照組(P<0.05)。8 dpf時,除了4、6 g/L外的實驗組心率均顯著低于對照組(P<0.05)。HONG等[34]發(fā)現(xiàn),海洋青鳉魚暴露在六溴環(huán)十二烷中5、8 dpf時的胚胎心率會顯著增加。在HUANG等[35]的研究中,海洋青鳉魚胚胎暴露在全氟辛烷磺酸中10 dpf時心率顯著降低,而在4、6、8 dpf時又存在不同的結(jié)果,且在暴露于4、16 mg/L全氟辛烷磺酸中導(dǎo)致靜脈竇(SV)-動脈球(BA)距離增大并改變心率。這與本研究中不同暴露時間不同鹽濃度暴露下存在不同的結(jié)果類似。

圖7 不同暴露時間與鹽濃度下的胚胎心率

心臟是胚胎發(fā)育過程中的最開始出現(xiàn)功能化的器官之一,其對環(huán)境污染物十分敏感[36-37]。胚胎的存活率很大程度上取決于心臟功能是否正常[38-39]。海洋青鳉魚心臟在5 dpf基本發(fā)育完全,此時心臟、頭部及其他內(nèi)臟組織血液循環(huán)系統(tǒng)管道也隨之發(fā)育健全并能夠觀察到強烈的心跳信息。8 dpf時,胚胎系統(tǒng)基本完成直至孵化出仔魚[24]125537。多項研究表明,在不同污染物的暴露下海洋青鳉魚胚胎或斑馬魚胚胎都存在心率紊亂的現(xiàn)象[40-43],這代表著對心臟功能不同程度的損傷。這同樣與環(huán)境污染物介導(dǎo)的過量ROS有關(guān)[31]106-107。不同廢鹽濃度和暴露時間下孵化的仔魚中均存在不同程度的心臟拉長和心包囊腫等畸形,而心包囊腫形成會一直影響胚胎發(fā)育進而影響心臟結(jié)構(gòu)導(dǎo)致死亡[44]。因此可能是廢鹽暴露下影響了心臟的正常發(fā)育從而導(dǎo)致心率變化。

2.4 系統(tǒng)損傷實驗結(jié)果

2.4.1 蛋白質(zhì)含量定量分析

為防止由于勻漿濃度差異對實驗結(jié)果造成影響,首先測定了實驗樣本的蛋白質(zhì)濃度,后續(xù)通過均一化方法衡量廢鹽暴露對海洋青鳉魚胚胎內(nèi)生物標志物的影響。蛋白質(zhì)定量標準曲線擬合方程和定量結(jié)果如圖8所示。

2.4.2 抗氧化系統(tǒng)損傷

選擇SOD、CAT、GSH和GST作為不同廢鹽濃度暴露下5、8 dpf時胚胎的抗氧化標記物,其檢測結(jié)果如圖9所示。

圖9 不同暴露時間與鹽濃度下胚胎的抗氧化系統(tǒng)標記物活性或含量

SOD活性在廢鹽實驗組中均呈現(xiàn)隨濃度上升而上升的趨勢。在5 dpf時,除雜鹽組和2、6 g/L的實驗組與8 dpf時的除雜鹽組和2 g/L實驗組的SOD活性顯著低于對照組(P<0.05),8 dpf時14 g/L實驗組的SOD活性顯著高于所有其他組;CAT活性在5、8 dpf時的廢鹽實驗組均顯著低于除雜鹽組(P<0.05),而除雜鹽組與對照組沒有顯著性差異(P>0.05)。

GSH含量在5 dpf時的14 g/L實驗組和8 dpf

時所有實驗組中顯著低于對照組(P<0.05),且在除雜鹽組與對照組沒有顯著差異(P>0.05);GST活性在5 dpf的除雜鹽組和5、8 dpf中所有實驗組均顯著低于相應(yīng)對照組(P<0.05)。

GSH是生物體內(nèi)的重要還原性化學(xué)物質(zhì),能夠清除人體內(nèi)的自由基。而GST能催化GSH結(jié)合各種親電子的外源化學(xué)物,通過有效轉(zhuǎn)化有害物質(zhì)或減少有機過氧化物以達到排毒效果[49-50]。研究表明,當氧化應(yīng)激超出機體的防御能力,會降低酶活性并影響抗氧化酶的合成[51]。實驗結(jié)果表明,廢鹽暴露下SOD率先發(fā)揮作用,活性上升,但GSH含量和GST活性均顯著下降,這與CAT的趨勢一致,結(jié)果與ZHAO等[52]的研究類似,說明胚胎內(nèi)活性氧超過胚胎防御能力不能被抗氧化系統(tǒng)清除,胚胎中發(fā)生了嚴重的氧化損傷、破壞了胚胎的抗氧化系統(tǒng),同時也可能影響了胚胎心臟的生長發(fā)育和心率并導(dǎo)致孵化時間的變化。

2.4.3 免疫系統(tǒng)

不同暴露時間與鹽濃度下海洋青鳉魚胚胎的LZM活性如圖10所示,LZM活性在5、8 dpf時的除雜鹽組、廢鹽實驗組均顯著低于對照組(P<0.05)。類似的是,JUHEL等[53]的研究中在馬卡西平的暴露下,雙殼類水生生物體內(nèi)LZM活性下降。MATOZZO等[54]的研究中在三丁基錫的暴露下,菲律賓蛤蜊的LZM活性下降。LZM參與抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗腫瘤等生物學(xué)功能,常用來評估污染物對生物體免疫系統(tǒng)的毒性作用[55-56]。LZM作為免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵生物標志物,在所有的實驗組中均被顯著抑制。這表明,不論是成分復(fù)雜的廢鹽還是缺少必要營養(yǎng)物質(zhì)的除雜鹽,均會對海洋青鳉魚胚胎的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。可能的影響包括誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、阻礙免疫功能、產(chǎn)生慢性免疫毒性等,抑制海洋青鳉魚仔魚的健康生長[21]113843。

圖10 不同暴露時間與鹽濃度下胚胎的LZM活性

3 結(jié) 論

(1) 實驗所選用的醫(yī)藥中間體行業(yè)廢鹽主要污染物成分為吡啶類、腈類有機物。廢鹽對海洋青鳉魚胚胎存在急性致死效應(yīng),96 h LC50為13.94 g/L。

(2) 廢鹽對海洋青鳉魚胚胎存在顯著的發(fā)育毒性,主要表現(xiàn)為累積死亡率增加、孵化時間改變和心率紊亂。

(3) 廢鹽暴露導(dǎo)致海洋青鳉魚胚胎抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激及損傷,影響胚胎生長發(fā)育。并對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生顯著影響,威脅種群發(fā)展。

(4) 經(jīng)實驗室處理后的除雜鹽中有機物含量顯著降低,對海洋青鳉魚胚胎的發(fā)育毒性顯著降低。除雜鹽對海洋青鳉魚胚胎LZM活性的顯著影響可能是由于缺乏正常海水中所含的營養(yǎng)物質(zhì)所導(dǎo)致的。