全外顯子組測序技術在產前胎兒超聲異常中的應用進展

喬夢茹 李奉瑾 姚欣雨 張玉萍

據報道,約2%～4%的孕婦產前超聲提示胎兒異常[1],造成胎兒異常的因素中遺傳因素最重要。遺傳因素所致的胎兒異常出生后常表現(xiàn)為智力障礙、生長發(fā)育遲緩、嚴重者可致殘疾甚至死亡,給家庭和社會帶來沉重的負擔。目前,對超聲異常胎兒,可通過產前診斷技術最大限度的排除遺傳性疾病,降低此類出生缺陷的發(fā)生。染色體核型分析是產前診斷的“金標準”,能檢測染色體的非整倍體異常及5 Mb以上的染色體結構異常,為32%的超聲異常胎兒明確病因[2]。拷貝數(shù)變異測序技術能檢測出核型分析無法檢測的微缺失和微重復,在染色體核型正常的超聲異常胎兒中額外檢出6%的致病性拷貝數(shù)變異[3],但仍有許多超聲異常胎兒無法明確病因。隨著二代測序技術的迅速發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn),全外顯子組測序(whole exome sequencing,WES )能在染色體核型分析和拷貝數(shù)變異檢測均未見異常時,將超聲異常胎兒的診斷率提高8%～10%[4]。本文將從WES在產前胎兒超聲異常中的應用、局限性及注意事項分別進行闡述。

一、WES在產前胎兒超聲異常中的應用

1.多系統(tǒng)異常 胎兒多系統(tǒng)異常在表型上往往表現(xiàn)為較大的臨床異質性,部分通過常規(guī)遺傳學檢測方法無法明確病因。近年來,多項研究利用WES在尋找胎兒多系統(tǒng)異常致病基因方面充分展現(xiàn)了其應用價值。Lord等[1]對143例多系統(tǒng)畸形胎兒行WES,診斷陽性率達15.4%(22/143),共涉及20個致病或可能致病性基因變異。Petrovski等[5]的研究發(fā)現(xiàn),WES在胎兒多發(fā)畸形的診斷性遺傳變異約為單發(fā)畸形的3倍(19%vs6%),同時還發(fā)現(xiàn)胎兒畸形數(shù)目越多,基因異常的檢出率越高。同樣,符芳等[6]的研究也表明,多系統(tǒng)異常胎兒WES的陽性檢出率明顯高于單系統(tǒng)異常(19.9%vs12.2%),證實了胎兒多系統(tǒng)異常與基因異常的高度相關性。因此,對染色體核型分析和拷貝數(shù)變異檢測陰性的多系統(tǒng)異常胎兒,WES可能會為其明確致病基因,預防遺傳病患兒的出生。

2.骨骼發(fā)育異常 胎兒骨骼發(fā)育異常(skeletal dysplasia,SD)是一類具有臨床異質性和表型異質性的骨-軟骨發(fā)育異常疾病,SD大多與調控骨骼發(fā)育的基因突變相關。張鑫悅等[7]對13例嚴重肢體短小的胎兒引產后行家系WES,診斷陽性率為76.9%(10/13),涉及的基因包括FGFR3、COL2A1、COL1A1等,其中FGFR3突變與SD關系最密切,FGFR3與配體成纖維細胞生長因子結合,引起受體酪氨酸激酶活化及自身磷酸化,促進細胞的增殖和分化,FGFR3突變可引起受體信號停止轉導,胞內效應基因表達異常,導致軟骨細胞增殖和分化障礙,最終出現(xiàn)各種骨骼發(fā)育畸形[8]。楊科等[9]應用WES對15例核型分析及拷貝數(shù)變異檢測陰性的SD胎兒分析,診斷率為10/15,累及的基因除常見的FGFR3、COL2A1基因外,還首次發(fā)現(xiàn)DYNC2H1、WDR35基因與短肋胸廓發(fā)育不良高度相關,豐富了基因致病突變譜和表型譜。因此,WES可以進一步識別SD的致病基因,對明確其產前遺傳學診斷有重要意義。

3.中樞神經系統(tǒng)畸形 胎兒中樞神經系統(tǒng)(central nervous system,CNS)畸形是一類由多種因素(遺傳、化學物、感染等)導致的顱腦神經系統(tǒng)發(fā)育異常。研究表明[10],超過80%的CNS畸形兒經染色體核型分析、拷貝數(shù)變異檢測技術仍未能明確病因,可能與單基因病有關。Yaron等[10]對86例拷貝數(shù)變異檢測陰性的CNS畸形胎兒行WES,38例存在致病基因變異,診斷率提高了44%。Baptiste等[11]對268例CNS畸形胎兒行WES,發(fā)現(xiàn)37例存在致病或可能致病的基因變異,且在多發(fā)中樞神經系統(tǒng)異常(19%)和多系統(tǒng)異常(16.7%)的診斷率明顯高于孤立的CNS畸形(7.2%)。因此,對于CNS畸形胎兒,特別是多發(fā)中樞神經系統(tǒng)畸形或合并其他系統(tǒng)異常時,在傳統(tǒng)產前診斷技術無法明確病因時更應重視WES的檢測。

4.先天性心臟發(fā)育畸形 胎兒先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是最常見的結構畸形,多數(shù)CHD患兒系遺傳因素所致。CHD胎兒中約16%～26%合并染色體異常,約3%～12%與基因變異有關[12-14]。研究表明NKX2.5、GATA4、TBX5是調控心臟發(fā)育的關鍵基因,對心臟傳導系統(tǒng)、各腔室的形成及維持正常心功能起重要作用[15]。Prendiville等[16]的研究在CHD胎兒中發(fā)現(xiàn)了NKX2.5基因的38個突變位點,在宮內主要表現(xiàn)為房間隔缺損、室間隔缺損、法洛四聯(lián)癥。許耘紅等[17]的研究顯示,214例CHD患兒中有8例存在GATA4雜合同義突變。此外,當CHD合并肢體畸形、腎臟畸形等心外畸形時往往提示存在某些遺傳綜合征,如心手綜合征、歌舞伎綜合征、Alagille 綜合征等,分別涉及TBX5、KMT2D、JAG1、NOTCH2等致病基因[18-19]。因此,WES不僅能提高CHD胎兒的診斷率,當懷疑存在某些遺傳綜合征時,還可將WES與傳統(tǒng)的遺傳學檢測技術同時進行,盡早明確遺傳學病因。

5.先天性泌尿系統(tǒng)發(fā)育異常 先天性泌尿系統(tǒng)發(fā)育異常(congenital anomalies of the kidney and urinary tract,CAKUT)約占先天性結構畸形的20%～30%[20]。拷貝數(shù)變異測序技術被認為是診斷CAKUT的一線檢測技術。隨著WES在產前診斷中的不斷應用,多項研究應用WES在4.8%～14%的兒童CAKUT病例中發(fā)現(xiàn)了致病基因變異[21-23],證實了CAKUT與單基因病的相關性。Lei等[24]通過家系WES對163例CAKUT樣本進行分析,診斷陽性率為12.3%(20/163),涉及26個致病或可能致病的基因變異。董敏等[25]在20例超聲提示腎臟囊性病變的胎兒中發(fā)現(xiàn)6例多囊腎,致病基因包括PKD1、PKD2、PKHD1。PKD1、PKD2基因突變引起其編碼的多囊蛋白功能缺陷,多種細胞信號通路異常導致細胞異常增殖,最終表現(xiàn)為多囊腎[26]。Shuster 等[27]對52例孤立性雙側腎臟回聲增強胎兒行基因檢測發(fā)現(xiàn),15例為常染色體隱性多囊腎,7例為常染色體顯性多囊腎,涉及的基因包括PKD1、PKHD1。因此,WES能提高CAKUT胎兒的致病性變異檢出率,是拷貝數(shù)變異檢測技術的有效補充。對于拷貝數(shù)變異檢測未見明顯異常的孤立性腎臟回聲增強,也應動態(tài)觀察胎兒腎臟發(fā)育情況,必要時需進一步行WES排除基因異常。

二、 WES在產前胎兒超聲異常中應用的挑戰(zhàn)和局限性

1.產前WES適用人群的選擇 首先,WES在產前診斷中的適用人群目前仍局限于影像學發(fā)現(xiàn)的胎兒結構異常,而影像學醫(yī)師、臨床醫(yī)師對胎兒結構畸形及相關遺傳學知識的掌握程度都可能影響WES的納入標準。其次,WES在不同系統(tǒng)胎兒結構畸形的應用價值不同,如胎兒多系統(tǒng)畸形、骨骼系統(tǒng)畸形與單基因病的發(fā)生最密切,中樞神經系統(tǒng)畸形、心血管畸形次之,而胸部畸形如肺囊腺瘤、隔離肺等與基因的關系極低,因此應個體化對待每一個病例。最后,對于有結構畸形或發(fā)育障礙的不良孕產史的孕婦,產前WES是遺傳學診斷的一種手段,對此類孕婦,需留存先證者標本,行先證者、夫妻二人的家系WES,如無法提供先證者標本,但可提供其臨床表型及病歷資料,可通過WES對夫妻二人行隱性基因攜帶者篩查,從而推斷先證者是否是由致病或可能致病基因導致的結構改變,為下次妊娠的選擇提供理論依據。

2.產前表型的局限性 WES是基于表型的數(shù)據分析,產前胎兒影像學檢查僅能提示有限的結構異常,且有些產前表型不具有特異性,對應的疾病譜較寬泛,目前尚缺乏統(tǒng)一的基因型和表型相關的產前數(shù)據庫,因此確認產前基因型和表型的相關性極具挑戰(zhàn)。隨著遺傳學疾病的不斷發(fā)展,對初次WES檢測未明確診斷的先天性結構畸形兒可行新增表型后的二次重分析,從而提高診斷陽性率。臨床醫(yī)師應對胎兒期臨床表型進行詳細記錄,并追蹤隨訪至出生后,將出生后的臨床表型、產前表型及基因型進行再次對比分析,從而擴充基因型-表型產前數(shù)據庫。

3.WES技術的局限性 產前WES僅針對具有臨床意義的基因進行分析,對于WES發(fā)現(xiàn)的致病或可能致病的變異,仍需一代測序進行驗證。WES本身受其測序深度和覆蓋率的影響,不能覆蓋非編碼區(qū)的變異及全部的蛋白質編碼序列,無法檢測到所有類型的遺傳變異,如染色體數(shù)目及結構異常、拷貝數(shù)變異、低水平嵌合體、三核苷酸重復擴增等。對于“假基因、重復區(qū)域、高度同源”的基因測序,WES檢測能力有限,表觀遺傳相關變異也無法檢出。因此,WES陰性結果尚不能除外所有的遺傳性疾病。

4.產前WES的倫理學問題 產前WES雖能為部分超聲異常胎兒明確基因診斷,但其引發(fā)的社會倫理學問題同樣備受關注。除外嚴重遺傳性疾病、致死性疾病,對于“非嚴重性遺傳病”胚胎的去留問題一直存有爭議。一方面,由于存在外顯率及表現(xiàn)度的差異,即使是明確的致病性變異,其癥狀嚴重程度也有可能不同。另一方面,對于成年期發(fā)病的疾病,患者在發(fā)病前可無任何臨床癥狀,此類胎兒是否需要終止妊娠也存有爭議。因此,在進行WES檢測前及檢測后,臨床醫(yī)師應充分與孕婦及家屬溝通可能存在的倫理問題,對WES檢測結果的解讀還應積極與多學科團隊共同合作,客觀公正地為孕婦及家屬提供最全面的信息,在充分知情同意下由其權衡選擇,必要時需啟動倫理委員會共同商討決定。

三、WES在產前胎兒超聲異常中應用的注意事項

1.檢測前咨詢:臨床醫(yī)師應根據孕婦及家屬的文化水平提供個體化咨詢,包括告知WES檢測的指征、優(yōu)勢和局限性及替代方案,詳細告知WES檢測的所有可能結果、診斷陽性率及檢測后仍無法明確診斷的可能性,同時還應告知孕婦及家屬可知情選擇是否報告與檢測目的不相關的發(fā)現(xiàn)等。最后由孕婦及家屬自主選擇并簽署知情同意書。

2.檢測后咨詢:(1)陽性結果:臨床醫(yī)師需詳細向孕婦及家屬解釋基因與疾病的相關性、疾病的遺傳方式、預后情況、復發(fā)風險等,對選擇繼續(xù)妊娠的孕婦,可提供宮內治療、新生兒科管理等咨詢;對選擇終止妊娠的孕婦,可根據具體情況提供下次妊娠咨詢,如自然妊娠+產前診斷或胚胎植入前遺傳學診斷技術+產前診斷。(2)臨床意義未明的變異(VUS):臨床醫(yī)師應向患者及家屬解釋與表型相關的VUS,告知VUS還需結合父母樣本、家系驗證協(xié)助鑒定檢測結果[28],VUS還可能根據數(shù)據庫的更新及新增表型的出現(xiàn)需進行再次評估。(3)陰性結果:臨床醫(yī)師必須告知陰性結果仍無法完全排除胎兒患有某種遺傳病的可能性,這與WES的檢測范圍有限、胎兒期表型未完全顯現(xiàn)、臨床數(shù)據積累不完善等有關,應告知其定期數(shù)據再分析的重要性,必要時可進一步行全基因組測序技術(whole genome sequencing,WGS)。

綜上所述,WES能發(fā)現(xiàn)部分染色體核型分析及拷貝數(shù)變異檢測均無法檢測出的基因異常,在一定程度上彌補了傳統(tǒng)產前診斷技術的不足。WES由于本身技術的局限性,仍有部分超聲異常胎兒不能得到明確診斷。WGS能對包括非編碼區(qū)在內的整個基因組的DNA序列進行檢測,較WES覆蓋的范圍更廣,能進一步提高遺傳性疾病的檢出率,但其存在測序成本高、分析周期長、數(shù)據量龐大、數(shù)據解讀更困難等問題,并未在產前診斷領域得以廣泛應用。但我們相信隨著基因檢測技術及生信分析流程的不斷發(fā)展,產前基因型-表型數(shù)據庫將會逐步完善,WES及WGS勢必成為產前診斷胎兒遺傳病的重要手段,為產前遺傳咨詢和生育指導提供理論依據。