基于Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激途徑探究烏梅丸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的作用機(jī)制

陳靜 魏運(yùn)姣 羅超 黃利華 陳橙 段莎莎

摘要：目的 探究烏梅丸基于核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）抗氧化應(yīng)激途徑對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠的作用機(jī)制。方法 將70只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、UC組、美沙拉嗪組（MES組，0.82 g/kg MES）、烏梅丸低劑量組（WMW-L組，按生藥5 g/kg）、烏梅丸中劑量組（WMW-M組，按生藥10 g/kg）、烏梅丸高劑量組（WMW-H組，按生藥20 g/kg）和烏梅丸高劑量+Nrf2抑制劑ML-385組（WMW-H+ML-385組，烏梅丸按生藥20 g/kg+20 mg/kg ML-385），每組10只。末次給藥后，對(duì)小鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分及結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分。HE染色觀察小鼠結(jié)腸黏膜組織的病理學(xué)變化。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定小鼠血清和結(jié)腸組織白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6水平。硫代巴比妥酸比色法（TBA）測(cè)定小鼠血清和結(jié)腸組織丙二醛（MDA）含量。黃嘌呤氧化酶法測(cè)定小鼠血清和結(jié)腸組織超氧化物歧化酶（SOD）活性。二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）直接法測(cè)定小鼠血清和結(jié)腸組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-px）活力。免疫組織化學(xué)染色法觀察小鼠結(jié)腸組織中Nrf2的陽(yáng)性表達(dá)。Western blot檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織血紅素加氧酶1（HO-1）和NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 與對(duì)照組相比，UC組小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分升高，血清和結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA水平升高，結(jié)腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)升高，血清和結(jié)腸組織中SOD、GSH-px水平降低（P＜0.05），結(jié)腸黏膜損傷嚴(yán)重。與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠相應(yīng)指標(biāo)變化與上述相反，而結(jié)腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），結(jié)腸黏膜損傷減輕。WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組各指標(biāo)變化呈劑量依賴(lài)性。WMW-H組與MES組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ML-385減弱了高劑量烏梅丸對(duì)UC小鼠結(jié)腸黏膜損傷的改善作用。結(jié)論 烏梅丸可能通過(guò)激活Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激途徑減輕UC小鼠的結(jié)腸黏膜損傷。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸炎， 潰瘍性；NF-E2相關(guān)因子2；抗氧化反應(yīng)元件；氧化性應(yīng)激；烏梅丸

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230533

The mechanism of Wumei pill on ulcerative colitis in mice based on Nrf2/ARE antioxidant stress pathway

CHEN Jing1， WEI Yunjiao2△， LUO Chao1， HUANG Lihua3， CHEN Cheng1， DUAN Shasha1

1 Department of Pediatrics， 2 Department of Pharmacy， 3 Department of Pathology， the Fourth Hospital of Wuhan，

Wuhan 430034， China

△Corresponding Author E-mail： grqxafrou5@163.com

Abstract： Objective To explore the mechanism of Wumei pill on ulcerative colitis （UC） in mice based on the anti oxidative stress pathway of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）/antioxidant response element （ARE）. Methods Seventy SPF male C57BL/6 mice were randomly divided into the control group， the UC group， the mesalazine group （MES group， 0.82 g/kg MES）， the low dose Wumei pill group （WMW-L group， 5 g/kg crude drug）， the middle dose Wumei pill group （WMW-M group， 10 g/kg crude drug）， the high dose Wumei pill group （WMW-H group， 20 g/kg crude drug） and the high dose Wumei pills+Nrf2 inhibitor ML-385 group （WMW-H+ML-385 group， Wumei pills crude drug 20 g/kg+20 mg/kg ML-385）， with 10 rats in each group. The disease activity index （DAI） score and colonic mucosa injury score were performed in mice after the last administration. Pathological changes of colonic mucosa in mice were observed by HE staining. The levels of interleukin （IL） -1β， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and IL-6 in serum and colon tissue of mice were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The content of malondialdehyde （MDA） in serum and colon tissue of mice was determined by thiobarbituric acid colorimetry （TBA）. The activity of superoxide dismutase （SOD） in serum and colon tissue of mice was measured by xanthine oxidase method. The activity of glutathione peroxidase （GSH-px） in serum and colon tissue of mice was determined by direct method with dithiodinitrobenzoic acid （DTNB）. The positive expression of Nrf2 in colon tissue of mice was observed by immunohistochemistry. The expression of heme oxygenase-1 （HO-1） and NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1 （NQO1） proteins in colon tissue of mice were detected by Western blot assay. Results Compared with the control group， the DAI score， colonic mucosa injury score， colonic histopathology score， levels of IL-1β， TNF-α， IL-6 and MDA in serum and colonic tissue， and expression levels of Nrf2， HO-1 and NQO1 protein in colonic tissue of mice were increased in the UC group， levels of SOD and GSH-px in serum and colon tissue decreased （P＜0.05）， the colon mucosa of mice was seriously damaged. Compared with the UC group， changes of corresponding indexes were contrary to the above in the MES group， the WMW-M group and the WMW-H group. However， the expression levels of Nrf2， HO-1 and NQO1 proteins in colon tissue were increased （P＜0.05）， and the damage of colon mucosa in mice was alleviated. Changes of the above indexes were dose-dependent in the WMW-L group， the WMW-M group and the WMW-H group. There were no significant differences in the above indexes between the WMW-H group and the MES group. ML-385 attenuated the improvement effect of high dose Wumei pill on colon mucosa injury. Conclusion Wumei pill may alleviate the colon mucosal damage of UC mice by activating Nrf2/ARE antioxidant stress pathway.

Key words： colitis， ulcerative; NF-E2-related factor 2; antioxidant response elements; oxidative stress; Wumei pill

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種非特異性的消化系統(tǒng)炎癥性疾病，患者主要癥狀為腹瀉、體質(zhì)量下降、便血和腸道黏膜病理性損傷［1］。UC患者以青壯年人群多見(jiàn)，且難以痊愈、易復(fù)發(fā)［2-3］。由于UC的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，具體病因難以確定，因此探究UC的發(fā)病機(jī)制，尋找治療UC安全、有效的藥物成為臨床研究的重點(diǎn)。研究顯示，UC與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系，UC患者存在嚴(yán)重的氧化還原系統(tǒng)失衡［4-5］。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）途徑是一條重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，Nrf2是帽領(lǐng)（cap‘ncollar，CNC）轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激體系中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能維持細(xì)胞氧化還原的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)其與ARE結(jié)合時(shí)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化和抗炎基因的表達(dá)過(guò)程中具有重要作用［6-7］。烏梅丸來(lái)源于《傷寒論·厥陰病篇》，由烏梅、附子、干姜、細(xì)辛、川椒、桂枝、黃連、黃柏、人參、當(dāng)歸等十味中藥組成，具有平調(diào)陰陽(yáng)、和暢氣血等功效，常用于治療UC、心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤等［8］。已有大量證據(jù)表明烏梅丸治療UC具有顯著的作用，但其作用機(jī)制尚未明確。有研究者認(rèn)為可能與其多成分作用于多靶點(diǎn)，影響多個(gè)信號(hào)通路有關(guān)［9-10］。本研究建立UC小鼠模型，探究烏梅丸治療UC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 70只雄性C57BL/6小鼠，6周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2020—0018。所有小鼠飼養(yǎng)在武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2019—0013］SPF級(jí)環(huán)境中，溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度50%～60%，人工光照黑暗循環(huán)12 h/12 h，小鼠自由獲取食物和水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：H20220923），實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合3R原則。

1.1.2 主要藥物制備 烏梅丸由本院中藥房煎制，由烏梅16 g、細(xì)辛6 g、桂枝6 g、附子6 g、干姜10 g、川椒4 g、黃連16 g、黃柏6 g、人參6 g、當(dāng)歸4 g組成。以上藥物中附子先煎0.5 h，其他藥物加水浸泡0.5 h后加入，常規(guī)煎煮2次后混合、過(guò)濾、水浴、蒸發(fā)，制成1 g/mL（以生藥含量計(jì)）的水煎液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。美沙拉嗪緩釋顆粒購(gòu)自上海愛(ài)的發(fā)制藥有限公司，研磨后用100目篩過(guò)篩，以蒸餾水溶解配制成0.041 g/mL的混懸藥液，置于4 ℃儲(chǔ)存。

1.1.3 主要試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司；HE染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、NAD（P）H：醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase-1，NQO1）、GAPDH、Nrf2一抗和羊抗兔IgG二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所。凝膠成像儀、iMark多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 UC小鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)［11］方法和本實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建小鼠UC模型。造模前小鼠禁食24 h，不禁水。24 h后提起鼠尾將其懸空，使掙扎以排出大腸遠(yuǎn)端的糞便。隨機(jī)抽取60只C57BL/6小鼠，自由飲用5%DSS溶液7 d制備UC模型，第8天全部更換為蒸餾水。當(dāng)小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退、懶動(dòng)、體質(zhì)量下降，逐漸出現(xiàn)黏液膿血便，則說(shuō)明UC小鼠模型建立成功。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 將成功造模的60只UC小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為UC組、美沙拉嗪組（MES組，0.82 g/kg MES）、烏梅丸低劑量組（WMW-L組，按生藥5 g/kg）、烏梅丸中劑量組（WMW-M組，按生藥10 g/kg）、烏梅丸高劑量組（WMW-H組，按生藥20 g/kg）和烏梅丸高劑量+Nrf2抑制劑ML-385組（WMW-H+ML-385組，烏梅丸按生藥20 g/kg+20 mg/kg ML-385［12］），每組10只。另10只未造模小鼠設(shè)為對(duì)照組，自由飲用蒸餾水。本實(shí)驗(yàn)劑量的設(shè)置根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定。UC模型建立后MES組、WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組按相應(yīng)藥物劑量灌胃烏梅丸和MES，并腹腔注射等量生理鹽水；WMW-H+ML-385組灌胃相應(yīng)劑量烏梅丸，腹腔注射ML-385；對(duì)照組和UC組灌胃和腹腔注射等量的生理鹽水。每日1次，共14 d。

1.2.3 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分 末次給藥后，根據(jù)小鼠體質(zhì)量、大便性狀及便血情況進(jìn)行DAI評(píng)分［13］。0分：體質(zhì)量無(wú)降低，大便性狀正常，無(wú)便血；1分：體質(zhì)量降低1%～5%，大便松散，大便隱血；2分：體質(zhì)量降低6%～10%，大便松散，大便隱血；3分：體質(zhì)量降低11%～15%，大便稀溏，肉眼血便；4分：體質(zhì)量降低大于15%，大便稀溏，肉眼血便。

1.2.4 小鼠結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分 末次給藥后，所有小鼠禁食不禁水24 h，次日小鼠摘眼球取血，以3 000 r/min離心15 min，分離血清，分裝后置-20 ℃冰箱保存待測(cè)。所有小鼠脫頸處死，立即解剖，取出肛門(mén)至盲腸末端的整個(gè)腸段，迅速沿著腸系膜縱軸剪開(kāi)，用預(yù)冷生理鹽水漂洗干凈，然后將結(jié)腸平展開(kāi)，觀察腸黏膜的潰瘍和炎癥情況，對(duì)小鼠進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分［14］。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，正常無(wú)損傷；1分，充血但沒(méi)有潰瘍；2分，充血且腸壁增厚，無(wú)潰瘍；3分，1處較小潰瘍?cè)?，直?1 cm；4分，較大潰瘍，直徑1～2 cm，無(wú)腸管與周邊臟器粘連；5分：潰瘍?cè)钪睆?～2 cm，但腸管增厚，且與鄰近臟器嚴(yán)重粘連。之后將其剪成2部分，其中一部分放入-80 ℃保存，另一部分放入4%多聚甲醛固定，待制備病理切片。

1.2.5 HE染色觀察小鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)變化 取1.2.4中多聚甲醛固定后的結(jié)腸組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片（5 μm），根據(jù)HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色、封片，在光鏡下（400倍）觀察各組小鼠結(jié)腸的組織學(xué)改變情況，根據(jù)參考文獻(xiàn)［15］的病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。

1.2.6 血清和結(jié)腸組織炎性因子、氧化指標(biāo)的檢測(cè) 取1.2.4中血清和凍存的結(jié)腸組織，結(jié)腸組織制備組織勻漿，勻漿以3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清和結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

硫代巴比妥酸比色法（TBA）測(cè)定小鼠血清和結(jié)腸組織MDA含量。取勻漿液或血清0.5 mL置于10 mL試管中，加入2 mL 0.6%TBA，用保鮮膜封口，扎一小孔后沸水浴15 min，取出后用流水冷卻，1 000 r/min離心10 min，取上清液，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm、532 nm和600 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值。CMDA=6.45×（A532-A600）-0.56×A450。

采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定小鼠血清和結(jié)腸組織SOD活性，二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）直接法測(cè)定小鼠血清和結(jié)腸組織GSH-px活力，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.7 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織Nrf2蛋白表達(dá) 取1.2.5中制備的結(jié)腸組織切片，經(jīng)過(guò)烤片、脫蠟、梯度乙醇脫水等操作后，使用枸櫞酸溶液浸泡切片以修復(fù)抗原。3%過(guò)氧化氫孵育，10%胎牛血清室溫下封閉。然后使用PBS清洗，根據(jù)免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)加入Nrf2一抗（1∶400），4 ℃過(guò)夜。次日經(jīng)PBS洗滌后加入二抗，室溫孵育30 min；再次使用PBS洗滌，加入DAB顯色，蘇木素復(fù)染，清水沖洗，透明，二甲苯揮發(fā)、封片。在顯微鏡下觀察并拍照。棕褐色或棕黃色著色的為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.8 Western blot法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織HO-1、NQO1蛋白的表達(dá) 用RIPA裂解液提取1.2.4中凍存的結(jié)腸組織總蛋白，并根據(jù)BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉封閉后，將膜與HO-1（1∶1 000）、NQO1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。次日，在常溫下加入相應(yīng)二抗（1∶5 000），繼續(xù)孵育2 h，加入ECL試劑進(jìn)行顯色，在凝膠成像儀下進(jìn)行曝光，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參，利用Image Lab軟件對(duì)目標(biāo)蛋白的灰度值進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graph Pad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[[x] ±s]）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分比較 與對(duì)照組相比，UC組小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分升高（P＜0.05）；與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分下降（P＜0.05），WMW-L組變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分依次降低（P＜0.05）；WMW-H組小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分低于WMW-H+ML-385組（P＜0.05），與MES組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變 對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，層次分明，腺體排列有序，黏膜、固有層、肌層未見(jiàn)明顯異常。與對(duì)照組相比，UC組小鼠結(jié)腸組織隱窩結(jié)構(gòu)丟失、杯狀細(xì)胞減少，潰瘍形成，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠結(jié)腸組織隱窩結(jié)構(gòu)破壞減輕，上皮結(jié)構(gòu)和杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組結(jié)腸組織損傷依次減輕。WMW-H+ML-385組結(jié)腸組織損傷較WMW-H組加重。見(jiàn)圖1。

2.3 各組小鼠血清和結(jié)腸組織炎性因子比較 與對(duì)照組相比，UC組小鼠血清和結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠血清和結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05），WMW-L組無(wú)明顯變化（P＞0.05）。WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組小鼠血清和結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平依次降低（P＜0.05）；WMW-H組小鼠血清和結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平低于WMW-H+ML-385組（P＜0.05），與MES組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.4 各組小鼠血清和結(jié)腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與對(duì)照組相比，UC組小鼠血清和結(jié)腸組織中SOD、GSH-px水平降低，MDA水平升高（P＜0.05）。與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠血清和結(jié)腸組織中SOD、GSH-px水平升高，MDA水平降低（P＜0.05），WMW-L組無(wú)明顯變化（P＞0.05）。WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組小鼠血清和結(jié)腸組織中SOD、GSH-px水平依次升高，MDA水平依次降低（P＜0.05）；WMW-H組小鼠血清和結(jié)腸組織中SOD、GSH-px水平高于WMW-H+ML-385組，MDA水平低于WMW-H+ML-385組（P＜0.05），小鼠血清和結(jié)腸組織SOD、MDA、GSH-px水平與MES組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，UC組小鼠結(jié)腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠結(jié)腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），WMW-L組無(wú)明顯變化（P＞0.05）。WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組小鼠結(jié)腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)依次升高（P＜0.05）；WMW-H組小鼠結(jié)腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)高于WMW-H+ML-385組（P＜0.05），與MES組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2—5。

3 討論

UC的發(fā)病原因目前尚未明確，研究認(rèn)為UC的發(fā)生發(fā)展與環(huán)境、遺傳、免疫、精神心理等因素密切相關(guān)［16］。研究顯示，在全世界范圍內(nèi)UC的患病率較高［17］。目前臨床治療UC一般采取控制炎癥、抑制免疫反應(yīng)等手段為主。本研究采取DSS誘導(dǎo)小鼠發(fā)生UC，這種建模方法與人類(lèi)患UC相似，造模方法簡(jiǎn)便，成功率高，是研究UC常用的模型。氧化應(yīng)激與UC的發(fā)病密切相關(guān)，是UC重要的發(fā)病機(jī)制之一。SOD、GSH-px水平降低和MDA水平升高標(biāo)志體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的過(guò)度激活，能客觀反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)組織的損傷程度［18］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，UC組小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分、血清和結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6及SOD、GSH-px水平均升高，MDA水平降低，與蔣曉梅等［14］研究結(jié)果一致，提示DSS可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生結(jié)腸炎性損傷和氧化應(yīng)激損傷，UC小鼠模型構(gòu)建成功。

烏梅丸是中醫(yī)中“寒熱并用、溫清結(jié)合、斂肺固澀”的代表方，方中重用味酸之烏梅，取其酸主收澀，可澀腸止瀉；川椒、細(xì)辛、附子、桂枝、干姜均為辛熱之品，既可溫中祛寒，又可溫腎暖脾而助運(yùn)；黃連、黃柏味苦性寒，苦能下蛔，寒能清熱，可清熱燥濕止痢，人參、當(dāng)歸益氣補(bǔ)血，扶助正氣，且合桂枝養(yǎng)血通脈，調(diào)和陰陽(yáng)以解四肢厥冷。全方組寒熱并用，邪正兼顧，攻補(bǔ)兼施，通理氣血，調(diào)和三焦，共奏溫中補(bǔ)虛、清熱燥濕止痢之功效［19-20］。烏梅丸對(duì)UC具有顯著的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，烏梅丸對(duì)2，4，6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的UC模型大鼠具有顯著的調(diào)節(jié)作用，且可通過(guò)抑制Toll樣受體/核轉(zhuǎn)錄因子-κB/髓樣分化因子8（TLRs/NF-κB/myD88）信號(hào)通路的活化降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，減少炎性因子釋放，從而減輕UC反應(yīng)［21-22］。本研究結(jié)果顯示，與UC組相比，WMW-M組、WMW-H組小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分、血清和結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA水平顯降低，血清和結(jié)腸組織中SOD、GSH-px水平顯著升高；與上述研究一致，說(shuō)明使用烏梅丸對(duì)UC小鼠結(jié)腸黏膜損傷的修復(fù)作用比自然修復(fù)效果好，提示烏梅丸，尤其是高劑量烏梅丸可以減輕UC小鼠的結(jié)腸黏膜損傷，其機(jī)制與降低炎癥反應(yīng)、改善氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

正常生理狀態(tài)下，Nrf2存在于細(xì)胞質(zhì)中且處于失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥、紫外線(xiàn)輻射或氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，Nrf2活化從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE結(jié)合，并激活A(yù)RE下游一系列抗氧化基因的表達(dá)，誘導(dǎo)GSH-px、SOD等多種抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶（如HO-1、NQO1）的產(chǎn)生，從而加速清除氧自由基等氧化物質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，減輕機(jī)體損傷［23］。林培琦等［24］研究發(fā)現(xiàn)Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活能減輕DNA損傷、促進(jìn)受損DNA的修復(fù)和抑制放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減輕放射治療中的組織損傷。Ma等［25］研究發(fā)現(xiàn)Farrerol通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，有效抑制了順鉑誘導(dǎo)的炎癥和腎纖維化，為急性腎損傷的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，與UC組相比，MES組、WMW-M組、WMW-H組小鼠結(jié)腸組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)顯著升高；WMW-L組、WMW-M組、WMW-H組各指標(biāo)變化呈劑量依賴(lài)性。提示烏梅丸可能通過(guò)激活Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激途徑減輕UC小鼠的結(jié)腸黏膜損傷。為驗(yàn)證此猜想，本研究采用Nrf2抑制劑ML-385來(lái)干預(yù)高劑量烏梅丸組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ML-385減弱了烏梅丸對(duì)UC小鼠結(jié)腸黏膜損傷的改善作用，提示烏梅丸對(duì)UC小鼠結(jié)腸黏膜損傷的改善作用與激活Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激途徑相關(guān)。

綜上所述，烏梅丸可能通過(guò)激活Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激途徑減輕UC小鼠的結(jié)腸黏膜損傷。本研究為UC的靶向治療和發(fā)病機(jī)制研究提供了新的依據(jù)。然而，烏梅丸是否通過(guò)其他途徑和分子機(jī)制治療UC尚待進(jìn)一步探究。

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（2023-04-18收稿 2023-05-18修回）

（本文編輯 陳麗潔）