三種酶前處理對香蕉酵素理化性質(zhì)、生物活性及感官的影響

李天昊，位紹文，毛偉健,3，姜秀蘭，薛彥華，丁洪發(fā)，蓋凌云，程凡升,5,*，徐海忠,*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣技術(shù)中心，山東青島 266109；3.山東省特種食品技術(shù)創(chuàng)新中心，山東青島 266109；4.山東天同食品有限公司，山東臨沂 276000；5.青島特種食品研究院，山東青島 266109）

水果酵素是一種發(fā)酵食品，是指以可用于食品加工的水果為主要原料，添加或不添加輔料，通過微生物發(fā)酵制成，含有特定的生物活性成分，適合人們食用[1]。其不僅含有植物本身的多種維生素、酶和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[2]，還通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生了新的次生代謝物及活性成分，可滿足人們對口感、風(fēng)味、營養(yǎng)以及健康功能的需求[3-4]。姜忠麗等[5]研究證實糙米酵素有效成分具有抗氧化作用，可加速自由基的消除，防止各種細胞的氧化損傷，進而增強生物體內(nèi)新陳代謝的作用。林金鶯等[6]在諾麗酵素長效抗自由基的探究中得出諾麗酵素具有強而穩(wěn)定的抗自由基能力、抗疲勞作用。目前，酵素產(chǎn)品已經(jīng)成功實現(xiàn)商業(yè)化，并在國內(nèi)外市場上有廣闊的發(fā)展空間[7-9]。

香蕉（Musaspp.）屬芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa），含有較為豐富的營養(yǎng)功能性成分和活性物質(zhì)，具備保健功能。香蕉果肉富含各種營養(yǎng)成分，如礦物質(zhì)、抗性淀粉和膳食纖維等。此外，還含有酚類化合物、類胡蘿卜素、植物甾醇、胺類和抗氧化劑等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)賦予香蕉多種功能，如降血糖、降血壓、抗菌、抗氧化和抗?jié)兊萚10]。同時具備了降低膽固醇、預(yù)防胃潰瘍和高血壓等功效，是世界上最受歡迎的水果之一[11]。目前國內(nèi)香蕉主要的加工產(chǎn)品有香蕉飲料、香蕉粉、香蕉片等[10]。由于香蕉富含果膠、糖類、單寧等物質(zhì)，在加工過程中極易發(fā)生褐變，造成顏色和風(fēng)味劣變，同時由于粘度高，也使其渣汁分離困難，限制了香蕉加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[12]。傳統(tǒng)酵素食品在加工過程中通常直接添加微生物進行發(fā)酵[13]。但是，酶前處理會增加酵素本身的理化性質(zhì)和風(fēng)味，有研究發(fā)現(xiàn)，酶前處理會增加蜜桃酵素中可溶性固形物含量，對后期蜜桃酵素的品質(zhì)也有顯著影響[14]。但是，不同的酶是否會達到同樣的效果以及酶處理對香蕉酵素是否也會有同樣效果目前還不清楚。

本文通過比較自然發(fā)酵和不同酶前處理對香蕉酵素發(fā)酵過程中理化指標(biāo)、抗氧化活性、γ-氨基丁酸含量、超氧化物歧化酶活力以及風(fēng)味感官的不同變化，對其發(fā)酵規(guī)律進行初步探究，以期獲得美味和營養(yǎng)兼具的新型發(fā)酵飲品，同時為香蕉酵素產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉 高山甜香蕉，廣西；綿白糖（食品級） 大潤發(fā)超市；福林-酚、蘆丁、DNS、Al(NO3)3、NaNO2、葡萄糖、Na2CO3（食品級）、焦亞硫酸鉀（食品級）等分析純，北京索萊寶科技有限公司；DPPH、ABTS、FRAP、SOD、γ-氨基丁酸試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（10000 U/g）、果膠酶（30000 U/g）、木瓜蛋白酶（100000 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；商品化果蔬酵素發(fā)酵劑（植物乳桿菌N13、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、腸膜明串珠菌腸膜亞種和嗜熱鏈球菌） 安琪酵母股份有限公司。

SW-CJ-1F 型超凈工作臺 沃宏實驗儀器有限公司；ZDM-1101 型酶標(biāo)儀 卓的儀器設(shè)備（上海）有限公司；1 L 密封式發(fā)酵罐 青島市城陽區(qū)大潤發(fā)；101-00S 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上華脈儀器有限公司；DT-IO1200 型 pH 計 杭州秋籟科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香蕉酵素制備工藝 釀造方法參考之前的研究并進行修改[15-16]。挑選成熟后的香蕉，選取沒有腐爛和病斑的果實，帶果皮清洗并將其破碎，隨后裝入罐中，按1:2（v/v）果肉與水的比例進行混合，分三組，分別加入80 mg/kg 的纖維素酶，果膠酶和木瓜蛋白酶，分別在55 ℃、pH6，50 ℃、pH5.5 和55 ℃、pH6的條件下酶解4 h，以不添加酶的為空白對照，加入170 g/L（w/v）的綿白糖，用食品級Na2CO3調(diào)節(jié)pH至5.5 左右，隨后加入0.1 g/L（m/v）食品級焦亞硫酸鉀，攪拌均勻，封口靜置2 h，隨后95 ℃加熱5 min進行殺菌。利用商品化的發(fā)酵劑進行發(fā)酵，取1 g 溶于30 ℃溫水中活化，混勻靜置10 min。隨后以10 mL/L 的接種量接種，（37±1） ℃恒溫發(fā)酵，分別于發(fā)酵第0、24、48、72 h 同一時間點取樣。

1.2.2 pH 和總酸含量測定 取新鮮發(fā)酵液，10000 r/min 離心20 min，取上清液。pH 采用pH 計測定。總酸含量的測定參照食品中總酸的測定（GB 12456-2021）。

1.2.3 還原糖含量測定 采用DNS（二硝基水楊酸）法[17]，適當(dāng)修改。取500 μL 樣品加入1 mL DNS中，沸水浴20 min 后，于540 nm 測定吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，y=0.8881x+0.0561，R2=0.9981。

1.2.4 總酚和類黃酮含量測定 采用福林-酚法測定總酚含量[18]，適當(dāng)修改。取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)液或樣品液于15 mL 試管中，分別加入1 mL 福林酚顯色劑及3 mL 20% Na2CO3，混勻，于50 ℃水浴反應(yīng)30 min。在765 nm 波長下測定吸光度。每個濃度做3 組平行實驗，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.08473x-0.01762，R2=0.9894。測得的樣品吸光度代入回歸方程計算樣品中總酚含量。

采用NaNO2-Al（NO3）3法測定類黃酮含量[19]。準(zhǔn)確移取0.50 mL 樣品溶液置于25 mL 容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.50 mL，靜置5 min，再加入10% Al（NO3）3溶液0.50 mL，搖勻靜置5 min 后加入4% NaOH 溶液4.00 mL，搖勻后用60%乙醇定容，25 ℃條件下放置15 min 后，測定在510 nm 波長處的吸光度。配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入試液測定吸光度得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0288x-0.0079，R2=0.9994。測得的樣品吸光度代入回歸方程計算樣品中類黃酮含量。

1.2.5 SOD 酶活力測定 按照SOD 酶活力試劑盒進行測定。

1.2.6γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）含量測定 按照γ-氨基丁酸試劑盒進行測定。

1.2.7 抗氧化活性測定 DPPH 自由基、ABTS+自由基清除能力，F(xiàn)RAP 還原力（以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.3485x-0.0054，R2=0.9983）測定采用試劑盒進行檢測。

1.2.8 感官評價 采用9 點快感標(biāo)度法[20]評價發(fā)酵結(jié)束后香蕉酵素的感官性質(zhì)，從20～25 歲的學(xué)生中選出20 名進行感官評價，男女比例為1:1，組成評定小組。該小組對食品的顏色、酸甜度、香氣、味道、體態(tài)、風(fēng)味和整體接受性等七個性質(zhì)進行評價。評分分為9 個等級，對應(yīng)評價人員的喜好程度。其中，9 代表極度喜歡，8 代表很喜歡，7 代表中等喜歡，6 代表輕度喜歡，5 代表無所謂，4 代表輕度不喜歡，3 代表中等不喜歡，2 代表很不喜歡，1 代表極度不喜歡。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均重復(fù)3 次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式展示。采用Origin 2021 軟件繪圖；采用IBM SPSS Statistics 22 軟件進行單因素方差分析（ANOVA），其中P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶前處理發(fā)酵過程酵素理化性質(zhì)的變化

pH 和總酸是反映酵素整體發(fā)酵狀況的理化指標(biāo)[21]。不同酶前處理后，根據(jù)表1 和表2 的數(shù)據(jù)顯示，在發(fā)酵過程中，pH 和總酸含量呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。由表1 可以看出，發(fā)酵結(jié)束后，幾種酵素的pH 從4 降到了3 左右，說明發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)逐漸增加。根據(jù)表2 的數(shù)據(jù)顯示，在發(fā)酵過程中，第48 h 時發(fā)酵液的總酸含量從0.41±0.08～2.46±0.19 g/L 上升到2.23±0.19～3.81±0.11 g/L，這可能是由于此時碳源充足，乳酸菌可以利用碳源迅速產(chǎn)生乳酸和乙酸等物質(zhì)，導(dǎo)致總酸含量不斷上升。在發(fā)酵后期，隨著乳酸菌數(shù)量的減少，總酸含量在最后24 h 發(fā)酵期間，增幅減小。木瓜蛋白酶和果膠酶處理發(fā)酵后總酸含量差異不大，纖維素酶處理組總酸較高但差值并不大，相比于空白對照組三組酶處理后總酸含量較低。但總體而言酶處理對總酸含量有影響但影響幅度不大。

表1 香蕉發(fā)酵前后pH 變化Table 1 Changes in pH before and after fermentation of banana

表2 香蕉發(fā)酵前后總酸含量變化（g/L）Table 2 Changes in total acid content before and after fermentation of banana (g/L)

還原糖含量的變化可以反映出發(fā)酵液中微生物活動的情況[22]。由圖1 所示，在72 h 發(fā)酵過程中，所有組的糖含量均是下降的趨勢，在發(fā)酵過程中，乳酸菌等生物利用了大量的葡萄糖和果糖進行生長代謝。同時酶處理組在發(fā)酵72 h 時，總還原糖糖含量降低至130.00 g/L，而空白組還原糖含量為146.00 g/L。這可能是由于酶對香蕉多糖的降解，產(chǎn)生更多葡萄糖，從而加強乳酸菌對糖的利用而導(dǎo)致的[23]。

圖1 不同酶前處理發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.1 Changes in reducing sugar content during fermentation with different enzyme pretreatments

2.2 不同酶前處理發(fā)酵過程中總酚和類黃酮的變化

為了更加詳細地評價不同酶處理對酵素營養(yǎng)物質(zhì)的影響，檢測了總酚和類黃酮含量（圖2），幾組總酚的變化均為持續(xù)升高。空白組在第72 h 總酚含量提高到了原來的1.23 倍，其余三種酶處理組，均提高約1.31 倍左右，顯著高于對照組（P＜0.05）。其中，纖維素酶處理組相較于其他處理，總酚含量有明顯提升，這可能是在其處理下，果肉和果皮中與纖維素結(jié)合的不溶多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶的游離態(tài)多酚[24]。

圖2 不同酶前處理發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.2 Changes in total phenol content during fermentation with different enzyme pretreatments

類黃酮在自然界的植物中廣泛存在，具有抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化、保肝和降糖降脂等活性[25]。從圖3 可以看出，在發(fā)酵過程中，處理組的類黃酮含量逐漸上升，并在72 h 時達到最大值，分別為3.60 mg/g（纖維素酶）、3.22 mg/g（果膠酶）、3.26 mg/g（木瓜蛋白酶），并相較于24 h 提高了40%左右，與對照組出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），這與李江等[26]的研究相似。同時，在第72 h 時，空白對照組類黃酮含量出現(xiàn)了下降趨勢，這可能是因為是其中含有過氧化物酶導(dǎo)致氧化分解而下降[27]。而酶處理組持續(xù)升高，可能是因為酶水解糖類物質(zhì)從而加速黃酮醇類物質(zhì)與糖苷結(jié)合，從而成黃酮醇配糖體，其在發(fā)酵期間會發(fā)生水解，導(dǎo)致黃酮含量升高[15]。

圖3 不同酶前處理發(fā)酵過程中類黃酮含量的變化Fig.3 Changes in flavonoid content during fermentation with different enzyme pretreatments

2.3 不同酶前處理發(fā)酵過程中SOD 酶活的變化

由圖4 所示，在第48 h 時，無酶空白對照組的SOD 酶活力達到最大值，為93 U/mL，而在72 h 時又下降，這可能是因為空白組初始pH 較低，發(fā)酵后上升，降低了SOD 酶活力[28]。其余三組處理組，均在72 h 時達到最大值，分別為387 U/mL（纖維素酶）、209 U/mL（木瓜蛋白酶）和138 U/mL（果膠酶），較第1 d 分別提高了9 倍、4 倍和3 倍，均顯著高于對照組（P＜0.05）。在發(fā)酵24 h 左右，SOD 作為胞內(nèi)酶，可以通過微生物的細胞裂解釋放出來[29]，從而導(dǎo)致了SOD 酶活性在后續(xù)發(fā)酵過程中升高。

圖4 不同酶前處理發(fā)酵過程中SOD 酶活力變化Fig.4 Changes in SOD enzyme activity during fermentation with different enzyme pretreatments

2.4 不同酶前處理發(fā)酵過程中γ-氨基丁酸的變化

γ-氨基丁酸（GABA）是一種非蛋白質(zhì)的天然氨基酸，廣泛存在于植物、動物和微生物中[30]。γ-氨基丁酸具有抗衰老、降血壓、改善肝功能、調(diào)節(jié)激素分泌、改善睡眠、增強記憶力、防治肥胖等重要生理功能[31-32]。由圖5 可以看出，經(jīng)過發(fā)酵后，所有組的含量均有提升，對照組提高了25%左右，而處理組則提高了1 倍多，特別是纖維素酶處理組，從初始值4.93 μmol/mL 提高到11.45 μmol/mL，顯著高于對照組（P＜0.05）。這可能是由于酶的添加促進了酵素中蛋白和糖類的水解，從而促進其pH 和GABA 的變化[33]，同時GABA 在以糙米為材料發(fā)酵的酵素產(chǎn)品中也發(fā)現(xiàn)了同樣的趨勢[34]。

圖5 不同酶前處理發(fā)酵過程中γ-氨基丁酸含量的變化Fig.5 Changes in γ-aminobutyric acid during fermentation with different enzyme pretreatments

2.5 不同酶前處理發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化

進一步研究香蕉酵素發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化，發(fā)現(xiàn)不同的酶處理對發(fā)酵的抗氧化能力有明顯差異，具體結(jié)果見圖6～圖8。果膠酶，纖維素酶和木瓜蛋白酶均在第72 h 達到DPPH 自由基清除活力最大值，分別為14.1%、19.8%、15%，經(jīng)過72 h 發(fā)酵后，纖維素酶處理組DPPH 自由基清除力相較空白對照組提高了2～3 倍。這種提高的機制比較復(fù)雜，據(jù)Karaman 等[35]的報道，酚類物質(zhì)能夠輕易地釋放一個氫離子，這一特性是其強大自由基清除能力的主要原因。因此，酶前處理發(fā)酵使得DPPH 自由基清除力提高可能與酚類物質(zhì)的增加有關(guān)。同時，相較于未加酶處理組有顯著差異（P＜0.05）。

圖6 不同酶前處理發(fā)酵過程中DPPH 自由基清除力的變化Fig.6 Changes in DPPH radicals scavenging rate during fermentation with different enzyme pretreatments

圖7 不同酶前處理發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除力的變化Fig.7 Changes in ABTS+ radicals scavenging rate during fermentation with different enzyme pretreatments

圖8 不同酶前處理發(fā)酵過程中FRAP 還原力的變化Fig.8 Changes in FRAP reducing power during fermentation with different enzyme pretreatments

對于ABTS+自由基清除活力，三組酶處理組均在第72 h 達到最高值，分別為56.2%（空白）、68.8%（纖維素酶）、62.6%（木瓜蛋白酶）和63.2%（果膠酶），相較于24 h 提高了5%～6%，三種處理相較于空白對照組均表現(xiàn)出顯著差異，且纖維素酶的清除活力最高（P＜0.05）。未處理組與初始相比也有提高，但清除活力顯著低于其他處理組（P＜0.05）。酚類物質(zhì)與ABTS+自由基清除能力有關(guān)，而有機酸等物質(zhì)的芳香環(huán)數(shù)量、分子數(shù)量和羥基取代基的性質(zhì)也會對其產(chǎn)生影響[36]。

對于FRAP 還原力，所有處理組均在48 h 達到最大值，值得注意的是，纖維素酶處理組在FRAP 還原力上也表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢，三個時間點的活力均顯著高于其余處理組和對照組（P＜0.05），在48 h 時達到49.00 μmol/mL 左右，較24 h 提高了45%左右。其余兩種酶處理組在48 h 時與空白對照組也有顯著差異，但在72 h 時還原力顯著降低（P＜0.05）。酵素FRAP 還原力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，Yang等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，酵素的FRAP 能力與SOD 的活力和酚類物質(zhì)的有關(guān)，同時也發(fā)現(xiàn)了抗氧化能力在發(fā)酵后期降低的現(xiàn)象。綜上所述，DPPH 自由基清除活力和ABTS+自由基清除活力呈現(xiàn)上升趨勢，這可能與香蕉在發(fā)酵過程中活性物質(zhì)的變化以及乳酸菌代謝產(chǎn)物的作用密切相關(guān)。總的來說，纖維素酶在發(fā)酵48～72 h 時有利于香蕉酵素抗氧化活性的提升。

2.6 不同酶前處理發(fā)酵對酵素感官品質(zhì)的影響

感官評價是判斷食品是否受到消費者認可的重要因素。如圖9 所示，與其它酶處理組相比，空白對照組處理的香蕉酵素發(fā)酵后呈現(xiàn)暗黃色，不如其它組的棕色更具吸引力，因此平均分較低。對于酸甜度，纖維素酶處理組得分最高（7.14±0.06），而空白組的酸度明顯，導(dǎo)致得分較低。香氣方面，所有發(fā)酵組均有明顯的香蕉果香和發(fā)酵味，香味柔和，得分較高。味道方面，空白組口感較澀，而酶處理組的味道則是酸甜清爽。在外觀方面，所有樣品都有少量細小果肉沉淀，評分在5～6 分之間。在風(fēng)味方面，酶輔助發(fā)酵組具有明顯的果香味，得分高于對照組。總的來說，纖維素酶處理組和果膠酶處理組在整體包括整體印象和接受度方面得分較高。纖維素酶處理組的香蕉酵素在顏色（6.25±0.09）和味道（6.52±0.08）方面得分較高，而在酸甜度（7.14±0.06）、香氣（7.33±0.11）、風(fēng)味（7.14±0.08）和整體（7.42±0.09）得分方面最高。纖維素酶處理發(fā)酵有助于改善香蕉酵素的感官品質(zhì)，提高其可接受度。

圖9 不同酶前處理發(fā)酵過程中感官性質(zhì)的變化Fig.9 Changes of sensory properties during fermentation with different enzyme pretreatments

3 結(jié)論

本文利用了3 種不同的酶對香蕉進行前處理，探究其對香蕉發(fā)酵酵素品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，不同酶前處理對香蕉酵素發(fā)酵的酸度變化較為一致。不同酶前處理后，纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶對還原糖的利用要高于對照組。同時，纖維素酶處理使總酚和類黃酮含量顯著提升；纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶處理后SOD 酶活性均有顯著提高，纖維素酶處理下最為顯著。在三種酶中，纖維素酶和木瓜蛋白酶的處理有利于在發(fā)酵72 h 后提高香蕉酵素的抗氧化活性。經(jīng)過纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶處理后，纖維素酶處理的香蕉酵素中γ-氨基丁酸的含量最高，72 h 后提高了約25%。在感官評價方面，纖維素酶處理組得分最高。

綜上所述，纖維素酶處理顯著提高了發(fā)酵液的總酚含量、類黃酮含量和SOD 酶活性，增強了抗氧化活性，提高了γ-氨基丁酸含量并具備較好的感官品質(zhì)。此外，還需要進一步研究發(fā)酵選用的菌種、發(fā)酵的工藝流程和發(fā)酵過程內(nèi)部產(chǎn)物生成的相關(guān)性，以期為果蔬酵素開發(fā)更好的平臺和策略，同時也為高質(zhì)量香蕉酵素的開發(fā)提供新的依據(jù)和新思路。

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