響應(yīng)面法優(yōu)化螺旋藻多糖提取及脫色工藝

吳世林，陳 冉，陳靜蕓，楊 寧，李 坤，章 真,*，張榮慶

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.浙江清華長(zhǎng)三角研究院浙江省應(yīng)用酶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江嘉興 314000）

近些年來(lái)，螺旋藻被廣泛應(yīng)用在飼料、醫(yī)藥及食品等領(lǐng)域，因其富含豐富的蛋白質(zhì)、維生素、多糖以及多種脂肪酸和礦物質(zhì)等[1]。螺旋藻多糖（Spirulina platensispolysaccharides）是一種生理活性多糖，具有抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群等生物活性[2]。Rajasekar 等[3]研究表明，螺旋藻多糖具有強(qiáng)大的抗氧化活性，具有清除自由基的功效。Zhou 等[4]在探究螺旋藻多糖抑制鎘誘導(dǎo)的小鼠損傷的機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)螺旋藻多糖可以通過(guò)下調(diào)肝臟中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IL-γ）來(lái)改善鎘誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)疾病。與已知的抗癌藥物阿霉素相比，螺旋藻多糖能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，提高巨噬細(xì)胞活性，并能抑制A549 肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]。Lu 等[6]發(fā)現(xiàn)螺旋藻多糖可以調(diào)節(jié)肺癌小鼠的腸道微生物區(qū)系，并推測(cè)螺旋藻多糖通過(guò)FcεRI 信號(hào)通路和花生四烯酸代謝抑制肺癌。

如何高效地從植物、動(dòng)物及微生物中提取多糖，并最大程度保留其活性，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前，微藻多糖的提取多采用超聲提取法、熱水浸提法、微波輔助萃取法和酶法等[7]。超聲波提取法，憑借時(shí)間快效率高，被廣泛應(yīng)用在多糖的提取過(guò)程中，但超聲波在工作中容易使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，會(huì)影響到其提取率以及活性[8]。熱水浸提法利用水的極性大的特點(diǎn)，對(duì)于細(xì)胞具有較強(qiáng)的穿透力，可以使胞內(nèi)多糖溶解至水中，并且隨著溫度的升高，其溶解率也會(huì)相應(yīng)增大[9]；其缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)，效率低，一些酸性多糖可能無(wú)法浸提完全，造成損失[10]。微波輔助萃取法利用微波中的能量將細(xì)胞壁破壞，促進(jìn)細(xì)胞胞內(nèi)多糖快速溶解進(jìn)提取液中[11]，但其使用條件受限，不適合大規(guī)模制備[12]。酶解法是利用纖維素酶作用微藻細(xì)胞壁，破壞其結(jié)構(gòu)，使多糖成分溶解出[13]。酶解法提取效率高且具環(huán)境友好性，是一種高效綠色提取技術(shù)。但其成本較高，且酶保存條件苛刻[14]。

本研究采用熱堿液法提取螺旋藻多糖，并對(duì)其提取條件行優(yōu)化，熱堿液法浸提多糖，彌補(bǔ)了熱水浸提的缺點(diǎn)，可以使酸性多糖最大程度浸提出來(lái)，堿液對(duì)于細(xì)胞壁具有更強(qiáng)的穿透力。由于螺旋藻粗多糖含有大量色素，不利于后續(xù)純化，因此需要對(duì)其進(jìn)行脫色。近年來(lái)，使用較多的去除色素的方法是活性炭法[15]、柱色譜法[16]及過(guò)氧化氫法。過(guò)氧化氫是一種強(qiáng)氧化劑，能夠有效地將多糖分子中的色素氧化分解，從而達(dá)到脫色的目的，過(guò)氧化氫在分解后產(chǎn)生水和氧氣，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，具有無(wú)毒無(wú)害、操作簡(jiǎn)便、脫色高效等特點(diǎn)，因此本研究將對(duì)過(guò)氧化氫法脫色工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，以得到最佳脫色條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻干粉 陜西寶禾生物科技有限公司；濃硫酸 浙江中星化工試劑有限公司；苯酚 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；丙酮 北京索萊寶科技有限公司；30%過(guò)氧化氫 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；本實(shí)驗(yàn)其他所用試劑均為分析純。

HH-3A 水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；RE 2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海研承儀器有限公司；FD 1850 冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV1800PC 分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；Sorvall LYNX 6000 離心機(jī) Thermo Fisher。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熱堿浸提螺旋藻多糖單因素實(shí)驗(yàn) 技術(shù)路線[17]：取干藻粉2 g，乙醇脫脂，堿液浸提后4000 r/min離心10 min 棄去藻渣，然后使用3 倍體積無(wú)水乙醇沉淀過(guò)夜，4000 r/min 離心10 min 棄去上層溶液，沉淀經(jīng)乙醚、丙酮及無(wú)水乙醇清洗數(shù)次，之后冷凍干燥，得到螺旋藻多糖，采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量。

選擇以下4 個(gè)因素：提取溫度、時(shí)間、NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比。固定條件料液比1:20、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間3 h、NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%，通過(guò)改變單一條件分別取5 份考察料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL）、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%）對(duì)提取螺旋藻多糖效果的影響。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化熱堿浸提螺旋藻多糖工藝 分析比較單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度這3 個(gè)因素及其3 個(gè)水平，并通過(guò)Design Expert 13 進(jìn)行3 因素3 水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。表1 為試驗(yàn)的因子和等級(jí)。

表1 試驗(yàn)因素及水平Table 1 Test factors and horizontal

1.2.3 過(guò)氧化氫法螺旋藻多糖脫色單因素實(shí)驗(yàn) 當(dāng)堿性溶液的濃度較高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致多糖水解，所以pH設(shè)定為8，用6 mol/L 氫氧化鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。每個(gè)處理設(shè)定為10 mL，固定過(guò)氧化氫添加量15%，脫色時(shí)間60 min，脫色溫度50 ℃，改變單一的實(shí)驗(yàn)條件：過(guò)氧化氫添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、脫色時(shí)間（20、40、60、80、100 min）以及脫色溫度（30、40、50、60、70 ℃），用脫色率來(lái)反映不同條件的脫色效果。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化過(guò)氧化氫法螺旋藻多糖脫色工藝 比較分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定脫色時(shí)間、脫色溫度和過(guò)氧化氫添加量這3 個(gè)因素，并確定各因素的3 個(gè)水平，根據(jù)常見(jiàn)方法Box-Behnken，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的試驗(yàn)。表2 中顯示了試驗(yàn)的因子和水平。

表2 試驗(yàn)因素及水平Table 2 Test factors and horizontal

1.2.5 多糖含量的測(cè)定 采用苯酚硫酸法，將標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖干燥后，準(zhǔn)確稱取0.025 g，使用純水配制成0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。在試管中分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、0.9 mL，并用蒸餾水補(bǔ)齊至1.0 mL。再分別加入0.5 mL 6%苯酚溶液和2.5 mL 的濃硫酸，搖勻，室溫下反應(yīng)30 min。以第一管為空白對(duì)照，測(cè)定各管溶液490 nm 下的吸光度（A490），應(yīng)用Origin 2022 制作葡萄糖濃度（y）-A490（x）標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程[18]。最終得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=17.166x+0.002，R2=0.996。

1.2.6 得率的測(cè)定與計(jì)算 將經(jīng)過(guò)熱堿法提取得到的螺旋藻多糖提取液，利用苯酚硫酸法測(cè)出其含量，利用公式（1）計(jì)算出螺旋藻多糖得率。

式中：C 為多糖濃度（mg/mL）；V 為待測(cè)液定容體積（mL）；N 為稀釋倍數(shù)；M 為螺旋藻干粉質(zhì)量（mg）。

1.2.7 多糖保留率的測(cè)定與計(jì)算 脫色前后的多糖含量使用苯酚硫酸法進(jìn)行測(cè)定，然后帶入公式（2）進(jìn)行多糖保留率的計(jì)算。

式中：M1為脫色后多糖總量；M2為脫色前多糖總量。

1.2.8 脫色率的測(cè)定與計(jì)算 取3 mg/mL 螺旋藻粗多糖溶液，450 nm 波長(zhǎng)條件下，分別測(cè)定并記錄脫色處理前后的吸光值。多糖溶液脫色率由公式（3）計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本次實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)均為3 個(gè)重復(fù)，利用Origin 2022 和Excel 2019 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)計(jì)算和差異顯著性分析，利用Design Expert 13 軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱堿浸提螺旋藻多糖單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)螺旋藻多糖得率的影響 合適的料液比，可以顯著提高螺旋藻多糖的得率[19]。如圖1所示，隨著料液比中提取溶劑比例的逐漸增加，螺旋藻多糖的得率曲線呈現(xiàn)先快速增加，然后趨于平緩的趨勢(shì)，當(dāng)料液比超過(guò)1:20 g/mL 時(shí)，得率增長(zhǎng)較慢，螺旋藻多糖得到充分提取。提高提取液的比重，對(duì)于多糖的充分溶出起促進(jìn)作用，同時(shí)有利于提高后續(xù)除蛋白流程中多糖的保留率。而隨著水量的增多，會(huì)相應(yīng)地增加后續(xù)工藝的能耗及試驗(yàn)成本[20]，因此選擇料液比為1:20 g/mL，作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

圖1 料液比對(duì)螺旋藻多糖得率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

2.1.2 提取溫度對(duì)螺旋藻多糖得率的影響 如圖2所示，溫度在50～80 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，多糖得率迅速增加；溫度在80～90 ℃范圍內(nèi)，螺旋藻多糖的得率差異不顯著，推測(cè)螺旋藻中多糖已經(jīng)充分溶解在提取液里。升溫促進(jìn)分子運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)多糖分子溶出細(xì)胞，并增大溶解度[21]，但是升高水溫的同時(shí)，導(dǎo)致能耗的增加，提高了提取成本。因此，綜合考慮，將溫度70、80、90 ℃作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)3 水平。

圖2 提取溫度對(duì)螺旋藻多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖得率的影響 圖3 為不同提取時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖得率的影響曲線圖。從圖3 中可以發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間在1～3 h，隨著時(shí)間的推移，螺旋藻多糖的得率快速提高，反應(yīng)時(shí)間短，多糖溶出不充分，因此時(shí)間越長(zhǎng)，得率會(huì)越高，當(dāng)時(shí)間達(dá)到3 h 時(shí)，多糖提取接近完全，此后增加時(shí)長(zhǎng)，得率變化并不明顯。蛋白質(zhì)變性和多糖水解同時(shí)在進(jìn)行，延長(zhǎng)提取時(shí)長(zhǎng)，將導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變以及成本的增加[22]。因此，將提取時(shí)間2、3、4 h 作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)3 水平。

圖3 提取時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

2.1.4 NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)螺旋藻多糖得率的影響圖4 為不同NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)螺旋藻多糖得率的影響曲線圖。在堿性環(huán)境下，螺旋藻細(xì)胞壁容易被破壞，有利于加快細(xì)胞內(nèi)多糖及細(xì)胞壁中多糖的溶出[23]。從圖4 可以看出，螺旋藻多糖的得率，隨著NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)。過(guò)高的堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)阻礙得率的進(jìn)一步提高，過(guò)高的pH 會(huì)使多糖發(fā)生水解，并且會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性包裹部分多糖成為沉淀[24]。因此當(dāng)堿液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定值以后，增速緩慢，可能和蛋白變性，包裹多糖沉淀有關(guān)。因此，選擇NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、1.25%、1.5%作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)3 水平。

圖4 NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)螺旋藻多糖得率的影響Fig.4 Effect of NaOH concentration on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.2.1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間 （C） 3 個(gè)因素設(shè)為自變量，螺旋藻多糖得率設(shè)為因變量，用Box-Behnken 設(shè)計(jì)法進(jìn)行3 因素3 水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface analysis test design and results

2.2.2 模型的建立及顯著性分析 利用Design Expert 13 軟件對(duì)表3 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合、方差分析和顯著性檢驗(yàn)，得到以響應(yīng)值多糖得率Y 對(duì)各條件的編碼值的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

Y=5.8+0.13A+0.67B+0.14C-0.098AB-0.013AC-0.0025BC-0.56A2-0.52B2-0.48C2

由表4 所示，該模型的F值是149.74，P值小于0.0001，表示該模型極顯著。失擬項(xiàng)的P值是0.2077＞0.05，不顯著；該回歸方程的總決定系數(shù)R2=0.9948，調(diào)整決定系數(shù)R2=0.9882，說(shuō)明建立的回歸方程擬合的可行度高，能夠很好地對(duì)螺旋藻多糖得率進(jìn)行預(yù)測(cè)[25]。A、B、C、交互項(xiàng)BC 及三個(gè)平方項(xiàng)（A2、B2、C2）對(duì)螺旋藻多糖得率的影響達(dá)到了極顯著的效果（P＜0.01），而交互項(xiàng)AB 項(xiàng)對(duì)螺旋藻多糖得率的影響有顯著效果（P＜0.05），其他項(xiàng)不顯著。

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of variance and significance test of regression coefficient in response surface design test

由方差分析結(jié)果可以比較出各因素對(duì)螺旋藻多糖得率影響力的大小關(guān)系：提取溫度＞提取時(shí)間＞NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由圖5 可知，控制提取溫度不變時(shí)，隨著堿液NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，螺旋藻多糖的得率曲線呈現(xiàn)先迅速增加，后逐漸趨于平緩，在高濃度NaOH 的條件下，得率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因?yàn)樵寮?xì)胞在堿性環(huán)境下，細(xì)胞壁容易發(fā)生破裂，細(xì)胞內(nèi)以及細(xì)胞壁中的水溶性多糖進(jìn)而溶解進(jìn)提取液中，同時(shí)螺旋藻酸性多糖更容易溶出，但是，多糖水解也同時(shí)在進(jìn)行，高堿液溶液多糖還會(huì)出現(xiàn)脫酯和β-消去反應(yīng)[26]。圖6 顯示了NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖得率的影響，圖中響應(yīng)面描繪了不同NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間下螺旋藻多糖得率的變化趨勢(shì)。圖7 展示了提取溫度和提取時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖得率的影響，圖中的響應(yīng)面展示了不同提取溫度和提取時(shí)間下螺旋藻多糖得率的變化情況，提取溫度和提取時(shí)間二者交互作用達(dá)到極顯著水平。通過(guò)該模型的預(yù)測(cè)，螺旋藻多糖提取工藝最佳參數(shù)：NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.46%、提取溫度為90 ℃與提取時(shí)間3.79 h，多糖得率5.25%。

圖6 NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖得率的影響Fig.6 Effect of NaOH concentration and extraction time on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

圖7 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)螺旋藻多糖得率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature and time on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)以上所做的單因素實(shí)驗(yàn)和多因素試驗(yàn)的響應(yīng)面分析得到螺旋藻多糖熱堿液提取的最優(yōu)提取工藝條件，即NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、提取溫度為90 ℃、提取時(shí)間4 h 及料液比1:20 g/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平行3 組實(shí)驗(yàn)，得到螺旋藻多糖得率為5.18%±0.23%，與模型預(yù)測(cè)基本一致，說(shuō)明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)多糖得率。

2.3 過(guò)氧化氫法螺旋藻多糖脫色單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 過(guò)氧化氫添加量對(duì)脫色率的影響 根據(jù)圖8分析發(fā)現(xiàn)，隨著過(guò)氧化氫溶液添加量的增加，粗多糖溶液中色素的脫色率曲線呈現(xiàn)先快后慢的增加趨勢(shì)；過(guò)氧化氫與色素分子發(fā)生反應(yīng)，因此隨著過(guò)氧化氫添加量的增加，色素分子與過(guò)氧化氫反應(yīng)更充分，直至色素分子被氧化完全[27]。在過(guò)氧化氫添加量為25%時(shí)，色素分子已基本被氧化，且其脫色率相對(duì)于20%時(shí)變化不顯著。鑒于多糖水解、降解、成本等問(wèn)題，故選擇10%、15%和20%這3 個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖8 過(guò)氧化氫溶液添加量對(duì)脫色率的影響Fig.8 Effect of addition amount of hydrogen peroxide solution on decolorization rate

2.3.2 脫色時(shí)間對(duì)脫色率的影響 根據(jù)圖9 分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脫色時(shí)間在20～40 min 時(shí)間段內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，螺旋藻多糖的脫色率增速相對(duì)于后段較快；脫色時(shí)間進(jìn)行到40 min 后，螺旋藻多糖的脫色率增速較慢，且80 min 和100 min 時(shí)二者的脫色率差異并不顯著。推測(cè)多糖色素分子不斷地與過(guò)氧化氫發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到一定時(shí)間后，色素分子已經(jīng)充分反應(yīng)，進(jìn)而脫色率增加也相對(duì)緩慢[28]，因此，選擇40、60 和80 min 這3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖9 脫色時(shí)間對(duì)脫色率的影響Fig.9 Effect of decolorization time on decolorization rate

2.3.3 脫色溫度對(duì)脫色率的影響 根據(jù)圖10 分析發(fā)現(xiàn)，隨著脫色溫度的逐漸升高，過(guò)氧化氫法脫除螺旋藻多糖溶液中色素曲線增長(zhǎng)幅度較大，超過(guò)50 ℃后，脫色率增長(zhǎng)幅度逐漸減小，并且過(guò)氧化氫在60 ℃與70 ℃時(shí)的多糖脫色率無(wú)顯著差異。這是由于溫度過(guò)高時(shí)，過(guò)氧化氫分解過(guò)快[29]，失去氧化能力。因此，從能源損耗和多糖損失方面考慮，選擇40、50和60 ℃這3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖10 脫色溫度對(duì)脫色率的影響Fig.10 Effect of decolorization temperature on decolorization rate

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化脫色工藝結(jié)果

按照表2 的設(shè)計(jì)因素，運(yùn)用Design-Expert 設(shè)計(jì)軟件，對(duì)脫色工藝展開(kāi)了試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行了測(cè)試，并獲得了以下的試驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果如表5 所示，方差分析如表6 所示。

表5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Response surface analysis test design and results

表6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 6 Analysis of variance and significance test of regression coefficient in response surface design test

利用Design-Expert 軟件對(duì)表5 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到螺旋藻多糖脫色率（Y）對(duì)脫色時(shí)間（A）、脫色溫度（B）和過(guò)氧化氫添加量（C）的二次多項(xiàng)式回歸模型：

Y=84.99-0.1250A+0.0413B+0.03562C+0.1750AB-0.3050AC+0.1575BC-0.3478A2-0.8153B2-1.16C2

根據(jù)表6 可知該模型的F值是15.68，P值小于0.0001，表示該模型極顯著，失擬項(xiàng)的P值為0.0873＞0.05，差異不顯著，R2=0.9528，表明該模型選擇合理，可以對(duì)螺旋藻多糖脫色率進(jìn)行預(yù)測(cè)。其中，一次項(xiàng)過(guò)氧化氫添加量對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（P=0.0097＜0.01），由F值可以分析得到單因素的影響大小，從高到低是：過(guò)氧化氫添加量＞脫色時(shí)間＞脫色溫度；二次項(xiàng)A2對(duì)響應(yīng)值的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），B2、C2對(duì)響應(yīng)值的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

2.4.1 響應(yīng)曲面分析 響應(yīng)面圖曲面的傾斜度隨著兩因素之間交互作用的變化而變化[30]，交互作用越強(qiáng)，則其傾斜度越大[31]。由圖11 可知：保持脫色溫度不變化的情況下，當(dāng)時(shí)間增加時(shí)，螺旋藻多糖的脫色率曲線呈現(xiàn)逐漸增加而后逐漸下降；控制脫色時(shí)間不變時(shí)，溫度逐漸增加，螺旋藻多糖的脫色率曲線呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。由圖12 可知：控制過(guò)氧化氫的添加量保持不變時(shí)，隨著時(shí)間的增加，螺旋藻多糖的脫色率曲線呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。

圖11 脫色時(shí)間和脫色溫度對(duì)螺旋藻多糖脫色率的影響Fig.11 Effect of decolorization time and decolorization temperature on decolorization rate of polysaccharides from Spirulina platensis

圖12 脫色時(shí)間和過(guò)氧化氫添加量對(duì)螺旋藻多糖脫色率的影響Fig.12 Effect of decolorization time and hydrogen peroxide addition on decolorization rate of polysaccharides from Spirulina platensis

由圖13 可知：控制過(guò)氧化氫添加量不發(fā)生變化時(shí)，螺旋藻多糖脫色率曲線隨著脫色溫度的升高，呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，溫度達(dá)到一定值后，脫色率開(kāi)始顯著下降；當(dāng)脫色溫度一定時(shí)，隨著過(guò)氧化氫添加量的增加，螺旋藻多糖脫色率逐漸增加，過(guò)氧化氫添加量達(dá)到一定值后，脫色率開(kāi)始緩慢下降。

圖13 脫色溫度和過(guò)氧化氫添加量對(duì)螺旋藻多糖脫色率的影響Fig.13 Effect of decolorization temperature and hydrogen peroxide addition on decolorization rate of polysaccharides from Spirulina platensis

采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化過(guò)氧化氫法，預(yù)測(cè)得到最佳脫色工藝：過(guò)氧化氫溶液的添加量為16.88%、脫色時(shí)間為54.82 min、脫色溫度為50.31 ℃，色素脫除率是83.04%。進(jìn)一步驗(yàn)證所預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將上述參數(shù)修改為：過(guò)氧化氫溶液添加量為17%，脫色時(shí)間為55 min，脫色溫度為50 ℃，得到的實(shí)際脫色率為82.54%±0.03%，多糖保留率83.45%±0.13%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)際脫色率與模型預(yù)測(cè)相符，因此，基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化脫色工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

螺旋藻由于其含多糖比例低，得率不高，嚴(yán)重限制了其制備及應(yīng)用，因此提高其得率，除雜除色素十分必要[32]。目前，多糖的提取及脫色的方法有很多種，每一種方法都有著不同的特點(diǎn)。劉玉環(huán)等[33]采用內(nèi)部沸騰法優(yōu)化螺旋藻多糖的提取工藝，得到最佳提取條件為：40%乙醇、料液比1:14、溫度80 ℃、提取時(shí)間5 min，多糖得率是8.92%。Chaiklahan等[34]通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提螺旋多糖的條件，最優(yōu)條件是：料液比1:45、溫度90 ℃、時(shí)間120 min，在此條件下，螺旋藻多糖的得率為8.3%。本研究采用的熱堿液法，對(duì)酸性的螺旋藻多糖提取更充分，提取液不含有機(jī)溶劑，且用量少，大大降低了提取成本。杜玲等[35]比較了DEAE-纖維素法和活性炭法脫除螺旋藻多糖色素的效果，發(fā)現(xiàn)活性炭法脫除色素效果更好，確定了脫色溫度40 ℃、活性炭添加量1.5%、脫色時(shí)間50 min 是最佳脫色條件，多糖脫色率為64.58%，多糖保留率為64.09%；但是，本研究采用的過(guò)氧化氫法與其結(jié)果相比，具有更高的多糖脫色率和保留率，具有更高的脫色效率。秦宇等[36]使用過(guò)氧化氫法脫除日本蛇菰多糖色素，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化其脫色條件，在pH 為8 的條件下雙氧水脫色最佳工藝為：雙氧水用量為20%、脫色時(shí)間為46 min、脫色溫度為60 ℃，在此條件下蛇菰多糖的脫色率為84.21%，其結(jié)果與本文相似，可以發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫法在脫除色素的過(guò)程中，可以高效地去除色素，并且實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)單，易于操作。

3 結(jié)論

本文采用熱堿液法提取螺旋藻多糖，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析，分析發(fā)現(xiàn)影響螺旋藻多糖提取的因素，按影響大小依次為提取溫度＞提取時(shí)間＞NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)得到最佳提取條件是NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、提取溫度為90 ℃、提取時(shí)間4 h 及料液比1:20 g/mL，平行3 組實(shí)驗(yàn)，得到螺旋藻多糖得率為5.18%±0.23%，相對(duì)于傳統(tǒng)的提取方法，熱堿液浸提法可以將酸性多糖提取充分，縮短提取時(shí)間，減少提取成本。在優(yōu)化螺旋藻多糖的過(guò)氧化氫法脫色工藝中發(fā)現(xiàn)，所考察的3 個(gè)因素中，其影響效果從高到低為過(guò)氧化氫添加量＞脫色時(shí)間＞脫色溫度，最優(yōu)工藝參數(shù)：過(guò)氧化氫溶液添加量為17%，脫色時(shí)間為55 min，脫色溫度為50 ℃，得到的實(shí)際脫色率為82.54%±0.03%，多糖保留率為83.45%±0.13%。與常用的脫色方法大孔樹(shù)脂法、活性碳法及Sevage 法相比，過(guò)氧化氫法脫色具有脫色率高，時(shí)間短、效率高等特點(diǎn)[37]，但過(guò)量的過(guò)氧化氫也會(huì)和多糖發(fā)生氧化反應(yīng)，因此需要嚴(yán)格控制過(guò)氧化氫用量。本次研究所得結(jié)論為后續(xù)螺旋藻多糖分離純化以及生物活性的研究，奠定一定基礎(chǔ)。

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