2013—2022年某醫(yī)院肺泡灌洗液病原菌分布及耐藥性分析

許超 王笑塵 田磊

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430000

呼吸道的感染大都是多種細(xì)菌共同作用的結(jié)果，有較高的致死率和發(fā)病率，臨床上相關(guān)的診斷與治療需要病原學(xué)的支持［1］。由于上呼吸道存在很多正常菌群的感染，這使得傳統(tǒng)的痰培養(yǎng)很難得到臨床需要的診斷結(jié)果［2］。而在支氣管鏡協(xié)助下直接從下呼吸道深部取得的肺泡灌洗液避免了口腔等部位定植菌的污染和干擾，致病菌占比往往較高，能更好地指導(dǎo)臨床的診斷和治療［3］。在全球范圍內(nèi)，細(xì)菌耐藥性已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注，細(xì)菌的獲得性耐藥往往與抗生素的過(guò)度使用有關(guān)［4］。若能首先明確病原菌，而后完善其藥敏試驗(yàn)結(jié)果以進(jìn)行精準(zhǔn)治療，能有效減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。本研究報(bào)道了華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院2013—2022年肺泡灌洗液中檢出的主要病原菌及其耐藥性。

材料與方法

1.菌株

收集2013年1月至2022年12月華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院肺泡灌洗液所培養(yǎng)出的病原菌。

2.菌株的鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)

菌株鑒定采用質(zhì)譜儀（型號(hào)：MALDI Biotyper，德國(guó)布魯克公司，型號(hào)：AUTOF MS1000，安圖公司），結(jié)合細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)（型號(hào)：VITEK-2 COMPACT，法國(guó)梅里埃公司）和吲哚實(shí)驗(yàn)、奧普托辛敏感實(shí)驗(yàn)進(jìn)行綜合判定。藥敏實(shí)驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，SPN）體外藥敏實(shí)驗(yàn)采用血水解酪蛋白平皿，肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae，KPN）、銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PAE）、鮑曼不動(dòng)桿菌（acinetobacter baumanii，ABA）和金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus， SAU）采用水解酪蛋白平皿。頭孢他啶/阿維巴坦和多黏菌素B（Polymyxin B，PloyB）為BIO-KONT溫州市康泰生物科技有限公司產(chǎn)品，其余測(cè)試藥敏紙片、E試驗(yàn)條及培養(yǎng)基均為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品。藥敏結(jié)果判斷采用2023年CLSI M100標(biāo)準(zhǔn)，PloyB采用國(guó)內(nèi)專家共識(shí)，替加環(huán)素采用美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局推薦的標(biāo)準(zhǔn)。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

3.質(zhì)量控制

根據(jù)2023年CLSI M100標(biāo)準(zhǔn)選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、ATCC25923、ATCC27853、ATCC49619每周做1次室內(nèi)質(zhì)量控制，結(jié)果合格后開始檢測(cè)分析臨床分離病原菌的藥敏試驗(yàn)。

4.分析方法

分離所得病原菌的分布及藥敏結(jié)果的分析采用WHONET5.6版軟件進(jìn)行，對(duì)同一患者分離的相同病原菌，只對(duì)第1株菌做體外藥敏分析。

結(jié)果

2013年1月至2022年12月共送檢36 233例肺泡灌洗液標(biāo)本，其中檢出非重復(fù)病原菌11 801株，陽(yáng)性率32.57%。包括革蘭陰性菌8 231株，占比69.75%，革蘭陽(yáng)性菌1 378株，占比11.68%，真菌2 192株，占比18.57%。其中革蘭陰性菌以KPN、PAE和ABA為主，且KPN在所有致病菌中占比最高，革蘭陽(yáng)性菌以SAU和SPN為主，真菌以白色念珠菌和煙曲霉為主，所有肺泡灌洗液病原菌的檢出情況見表1。在所有檢出致病菌的患者中，男性均多于女性，且呼吸科和心臟大血管外科占比最多，見表2。

表1 肺泡灌洗液標(biāo)本的主要病原菌檢出情況[株（%）]

表2 檢出致病菌的患者分布情況[例（%）]

在肺泡灌洗液檢出的革蘭陰性菌中，KPN對(duì)哌拉西林，氨芐西林/舒巴坦，頭孢唑啉，頭孢呋辛，頭孢噻肟和環(huán)丙沙星的耐藥率均超過(guò)40.00%，對(duì)阿米卡星，亞胺培南、美羅培南和替加環(huán)素敏感性超過(guò)70.00%；PAE則對(duì)復(fù)方新諾明和米諾環(huán)素的耐藥率超過(guò)50.00%，對(duì)其他常見抗生素的敏感性均超過(guò)40.00%；而ABA對(duì)除米諾環(huán)素外的所有抗生素耐藥率均超過(guò)75.00%。具體耐藥率和敏感率情況，見表3。

表3 主要革蘭陰性菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率（%）

在最主要的致病菌KPN中耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant to klebsiella pneumoniae，CRKPN）的占比整體呈上升趨勢(shì)，在2018年和2022年出現(xiàn)下降趨勢(shì)，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院在2020開始對(duì)檢出的CRKPN加做頭孢他啶/阿維巴坦和PloyB體外藥敏實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)耐藥率在15.00%以下，但也出現(xiàn)了逐年上升的趨勢(shì)，見表4。

表4 2013—2022年CRKPN占比及其加做藥敏實(shí)驗(yàn)的耐藥性

肺泡灌洗液中分離的SAU對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺和替考拉寧的敏感率均為100.0%。其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）占52.20%，略高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-susceptible to staphylococcus aureus，MSSA），MRSA對(duì)除復(fù)方新諾明外的抗生素均相較于MSSA更加耐藥，具體耐藥率和敏感率情況，見表5。

表5 金黃色葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的敏感率與耐藥率（%）

肺泡灌洗液中分離的SPN對(duì)萬(wàn)古霉素和莫西沙星的敏感率均為100.0%，對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥率超過(guò)85.0%。其中，青霉素敏感肺炎鏈球菌（penicillin-susceptible to streptococcus pneumoniae，PSSP）占95.32%，遠(yuǎn)高于青霉素中介肺炎鏈球菌（penicillin-mediated Streptococcus pneumoniae，PISP）和青霉素耐藥肺炎鏈球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae，PRSP），具體耐藥率和敏感率情況，見表6。

表6 肺炎鏈球菌對(duì)抗菌藥物的敏感率與耐藥率（%）

討論

本研究顯示，在2013—2022年，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院送檢的肺泡灌洗液培養(yǎng)結(jié)果中，致病菌以革蘭陰性菌為主，且革蘭陰性菌的占比呈逐年上升趨勢(shì)，與楊青等［5］結(jié)果相同，真菌次之，革蘭陽(yáng)性菌占比最低。在革蘭陰性菌中，KPN、PAE和ABA的占比較高，與全國(guó)耐藥細(xì)菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)結(jié)果一致［6］。其中，KPN的占比在所有致病菌中最高，且呈整體上升趨勢(shì)。在革蘭陽(yáng)性菌中以SAU和SPN占比較高，也與全國(guó)耐藥細(xì)菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)結(jié)果一致［6］。其中，SAU占比每一年均為最高。在真菌中每一年占比最高的均為白色念珠菌。

在主要的革蘭陰性致病菌中，KPN對(duì)青霉素類、第二代頭孢、第三代頭孢和喹諾酮類抗生素較為耐藥，而對(duì)氨基糖苷類、碳青霉烯類和四環(huán)素類抗生素較為敏感。這可能與臨床上長(zhǎng)期大量使用第二代頭孢、第三代頭孢和喹諾酮類抗生素有關(guān)，長(zhǎng)期使用可能造成耐藥的產(chǎn)生。所以，臨床上對(duì)于KPN可優(yōu)先使用氨基糖胺類、碳青霉烯類和四環(huán)素類抗生素，以此節(jié)約治療時(shí)間。PAE的耐藥機(jī)制一般不是單個(gè)因素造成的，而是由多種機(jī)制相互協(xié)同的結(jié)果，耐藥機(jī)制非常復(fù)雜［7］。同一種抗生素的長(zhǎng)時(shí)間使用有可能導(dǎo)致其耐藥情況的發(fā)生，對(duì)于PAE感染的患者應(yīng)隨時(shí)根據(jù)其臨床癥狀以及藥敏結(jié)果適當(dāng)調(diào)整藥物的使用，以此降低PAE產(chǎn)生耐藥的概率。本研究中發(fā)現(xiàn)PAE第三代頭孢、第四代頭孢和氨基糖苷類抗生素均較為敏感，臨床可以優(yōu)先選擇使用。PAE可以在環(huán)境中長(zhǎng)期存在并且形成生物被膜，在臨床工作中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行接觸隔離和環(huán)境消毒。ABA對(duì)所有抗生素耐藥率均較高，相比之下米諾環(huán)素耐藥率較低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABA對(duì)亞胺培南（86.8%）和美羅培南（82.5%）的耐藥率高于全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的水平（80.4%）［6］。ABA等非發(fā)酵菌可以在環(huán)境中長(zhǎng)期存在并定殖，且耐藥率高，在臨床中需要更加關(guān)注操作的規(guī)范性及抗生素應(yīng)用的合理性。針對(duì)抗ABA治療，相關(guān)指南推薦舒巴坦復(fù)方制劑以及米諾環(huán)素等多種藥物聯(lián)合使用，或者以碳青霉烯類阿米卡星為基礎(chǔ)聯(lián)合替加環(huán)素和將PloyB作為基礎(chǔ)用藥的方案［8-9］。

在對(duì)CRPKN的逐年分析中發(fā)現(xiàn)CRKPN的占比越來(lái)越高，呈整體上升趨勢(shì)，這可能與抗生素的大量使用有關(guān)［10］。在2017年和2021年，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院發(fā)現(xiàn)CRKPN的占比較高時(shí)，分別于2018年對(duì)手術(shù)科室新入院患者進(jìn)行CRE的篩查工作，并對(duì)篩查陽(yáng)性患者進(jìn)行隔離措施，于2022年加強(qiáng)了臨床科室的衛(wèi)生宣教和CRE的篩查力度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2018年和2022年CRKPN的占比明顯下降，說(shuō)明對(duì)CRE的篩查隔離工作和臨床科室的衛(wèi)生宣教能有效減少CRKPN的產(chǎn)生。在CRKPN的治療中，由于一線抗生素使用的失敗，CRKPN相關(guān)的細(xì)菌感染已經(jīng)成為了威脅人類健康的重要因素［11-12］。《中國(guó)碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染診治與防控專家共識(shí)》［13］建議對(duì)將頭孢他啶/阿維巴坦作為CRKPN肺炎患者的首選治療方案，國(guó)外也有專家推薦將頭孢他啶/阿維巴坦作為碳青霉烯類抗生素的替代抗生素以及PloyB加替加環(huán)素作為CRKPN的一線治療抗生素［14-15］。CRKPN的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，有研究表明產(chǎn)肺炎克雷伯碳青霉烯酶和苯唑西林酶的KPN對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦敏感，而產(chǎn)新德里金屬酶β-內(nèi)酰胺酶的KPN對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦耐藥［16-17］。PloyB由于腎毒性高，且有其他替代抗生素的存在，在上世紀(jì)70年代臨床上就使用較少了［18］。近年來(lái)，由于多重耐藥的廣泛存在和新型抗生素的開發(fā)周期長(zhǎng)兩個(gè)因素，使得PloyB又重新被臨床上使用，并成為了革蘭陰性菌多重耐藥的主要抗菌藥物，有研究表明多黏菌素B的耐藥機(jī)制與脂多糖的修飾有關(guān)［19-20］。在2020年開始，本院對(duì)CRKPN加做頭孢他啶/阿維巴坦和PloyB的體外藥敏試驗(yàn)，2020—2022年結(jié)果顯示，CRKPN對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦和PloyB的耐藥率均在15.0%以下，但這3年耐藥率也呈上升趨勢(shì)，表明臨床須對(duì)此類更高級(jí)別抗生素的使用更加規(guī)范，以避免耐藥性的增長(zhǎng)。

本研究中未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素、利奈唑胺和替考拉寧耐藥的SAU，MRSA的占比高于MSSA的占比，MRSA對(duì)大部分抗生素的敏感性相較于MSSA更差，抗感染治療難度更大。在對(duì)SAU的治療方面，臨床可以優(yōu)先使用復(fù)方新諾明、替加環(huán)素、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺和替考拉寧。本研究中所有SPN對(duì)萬(wàn)古霉素和莫西沙星均敏感，且絕大多數(shù)為PSSP。SPN對(duì)紅霉素和克林霉素敏感性較差，其中PSSP比PISP、PRSP對(duì)左氧氟沙星和頭孢曲松的敏感性更好，抗感染治療時(shí)的難度更小。在SPN的治療中，可以盡量避免紅霉素和克林霉素的使用。同時(shí)，由于PISP和PRSP的發(fā)現(xiàn)較少，對(duì)PISP和PRSP的結(jié)果報(bào)告應(yīng)更加謹(jǐn)慎。

真菌常常寄生在人體皮膚表面或呼吸道黏膜處，多為條件致病菌，正常情況下不致病［21］。本次檢出的真菌中較多的是白色念珠菌和煙曲霉。念珠菌常常與人共生，其感染引起的肺炎發(fā)生概率較低，煙曲霉在通過(guò)呼吸道入侵到人體時(shí)多能被呼吸道黏膜處的免疫細(xì)胞所識(shí)別并及時(shí)清除，煙曲霉致病多發(fā)生在免疫功能低下的患者［22-23］。臨床上一般將在患者肺泡灌洗液中檢出的念珠菌等真菌考慮為呼吸道定植菌，認(rèn)為其并沒有診斷意義，所以對(duì)于檢出的真菌并未常規(guī)做藥敏分析［24］。然而，從2020年以來(lái)，本院白色念珠菌和曲霉屬真菌等真菌的檢出較之前有較大增長(zhǎng)，且近年來(lái)真菌感染及產(chǎn)生耐藥的案例時(shí)有發(fā)生，故臨床應(yīng)提高對(duì)真菌感染的重視［25］。新型隱球菌是一種條件致病菌，可存在于人體表與腸道等處，致病時(shí)可引起下呼吸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，其在腦脊液檢出時(shí)往往更具有臨床意義［26］。本次研究肺泡灌洗液中共檢出3例新型隱球菌感染，且患者均肺部癥狀不明顯，故未作相關(guān)藥敏分析。本研究存在一定的局限性，由于每年的收樣數(shù)量并不一致，近幾年的收樣數(shù)量高于之前，故最后統(tǒng)計(jì)的結(jié)論并不能很準(zhǔn)確地反映這十年的整體情況。

綜上所述，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院2013年1月至2022年12月送檢的所有肺泡灌洗液中，檢出病原菌主要為KPN、PAE、ABA和SAU等，以革蘭陰性菌居多，且CRKPN的占比和耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)。提示臨床應(yīng)合理應(yīng)用藥物，以防范更加廣泛的耐藥細(xì)菌產(chǎn)生。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明許超：研究設(shè)計(jì)與實(shí)施、數(shù)據(jù)采集與分析、文章撰寫、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱；王笑塵：文章修改、研究設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)分析、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱；田磊：文章修改、研究設(shè)計(jì)和實(shí)施、指導(dǎo)