克癀膠囊治療非酒精性脂肪性肝炎小鼠藥效學研究*

李曉靜 劉雅茹 李 冉 涂天智△ 胡義揚,3,4△

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病研究所 (上海, 201203) 2.科興生物制藥股份有限公司 3.上海市中醫臨床重點實驗室4.肝腎疾病病證教育部重點實驗室

隨著全球代謝綜合征、糖尿病和肥胖的增加,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的患病率也在急劇上升,據估計其全球患病率約為25%[1]。NAFLD的疾病譜包含非酒精性肝脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝細胞癌[2]。NASH是NAFLD 的嚴重類型,其特征是一種以肝脂肪變性、肝細胞損傷、炎癥和纖維化為組織學特征的慢性肝病,而NASH合并纖維化患者可能會進展為肝硬化、門靜脈高壓或肝細胞癌[3]。雖然在疾病流行病學、發病機制和治療靶點的了解方面取得了穩步進展,但在治療領域進展緩慢。目前還沒有美國食品藥品監督管理局(FDA)獲批的治療NASH的特定藥物,NASH治療的藥物研究仍是國際熱點[4]。

克癀膠囊主要成分有三七、黃連、黃芩、黃柏、大黃、山銀花、人工牛黃及麝香等十六味中藥組成,有清熱解毒、活血利濕、化瘀散結之功效,主要應用于急慢性肝炎的濕熱內蘊、瘀血內阻證。臨床研究顯示克癀膠囊對急性肝炎和慢性肝炎具有良好的療效[5]。前期運用高脂飲食誘導的NAFLD大鼠模型,發現克癀膠囊對NAFLD大鼠肝臟病變程度、血清TC及LDL-C水平具有改善作用[6]。為進一步明確克癀膠囊藥效,本實驗運用高脂飲食高糖飲水(HFHS)誘導的NASH小鼠,觀察克癀膠囊治療NASH的作用,以期為臨床推廣應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6J雄性小鼠60只,體重21～25 g,購自上海吉輝實驗動物有限公司,動物生產許可證編號:SCXK(滬)2012-0014,實驗動物使用許可證編號:SYXK(滬)2021-0005。小鼠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心,適應性飼養1周,觀察無異常后開始實驗。

1.2 實驗藥物與試劑 克癀膠囊(深圳市同安藥業有限公司,批號191108),奧貝膽酸(陽性對照藥,Med Chem Express公司,批號61353)。甘油三酯(TG)試劑盒(貨號:F001-1-1),丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(貨號:C009-2-1),天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(貨號:C010-2-1),γ谷氨酰轉移酶(GGT)試劑盒(貨號:C017-2-1),HE染色試劑盒(貨號:D006-1-3),油紅O試劑盒(貨號:D027-1-3),均購自南京建成生物工程研究所;血糖試紙購自羅氏診斷產品有限公司(貨號:220811);血清胰島素ELISA試劑盒購自Crystal chem 公司(貨號:90080)。

1.3 主要儀器 酶標儀(TECAN公司),石蠟包埋機(Lecia公司),冷凍離心機(Sigma公司),熒光倒置顯微鏡(Olympus公司),7020全自動生化分析儀(HITACCHI公司)。

1.4 動物造模、分組及藥物干預 60只SPF級C57BL/6J雄性小鼠,隨機分為正常組(Ctrl組)10只和高脂高糖組50只。正常組予以對照飼料(Research diet 12450J),飲用雙蒸水;高脂高糖組予以高脂飼料(Research diet 12492i),飲用濃度為42 g/L的糖水(糖水配比為55%果糖和45%蔗糖),造模12周。

12周末將高脂高糖組分為模型組(HFHS組),克癀膠囊低、中、高劑量組(KL、KM、KH組),奧貝膽酸組(OCA組),每組10只。造模第13周首日開始給藥,克癀膠囊低、中、高劑量組小鼠分別灌胃0.5、1、2 g/kg克癀膠囊溶液,奧貝膽酸組小鼠灌胃10 mg/kg奧貝膽酸溶液,以上藥物均以0.4%的羧甲基纖維素鈉溶液配制,用藥組小鼠予以相應藥物,灌胃體積為0.1 ml/10 g,1次/d,連續6周干預。正常組和模型組小鼠分別給予等體積的0.4%羧甲基纖維鈉溶液。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 肝組織TG含量 稱取小鼠肝組織(50±2 mg),使用無水乙醇丙酮提取肝組織中TG,運用TG檢測試劑盒檢測肝組織中TG含量,實驗操作步驟參考試劑盒說明書。

1.5.2 血清ALT,AST和GGT活性檢測 采用ALT、AST和GGT檢測試劑盒檢測。

1.5.3 血清TG、TC及HDL-C、LDL-C、FFA檢測 將各組小鼠血清樣本各取120 μl送至上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科協助檢測,檢測血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、FFA水平。

1.5.4 胰島素抵抗指數 實驗結束當天,小鼠禁食12 h,換用正常水,處理小鼠時取3 μl血液滴于血糖試紙上,通過血糖儀測得小鼠的空腹血糖(FBG)。通過胰島素ELISA試劑盒測定空腹胰島素(INS)。HOMA-IR=(FBG 測量值*INS 測量值)/22.5。

1.5.4 肝組織HE染色 選取肝大葉,修剪肝組織為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小的2塊方塊,置于10%中性甲醛緩沖液固定72 h后,行脫水、包埋、切片、HE染色處理,并進行NAS評分分析(表1)。

表1 非酒精性脂肪性肝病NAS評分

1.5.5 肝組織油紅O染色 選取肝大葉,修剪肝組織為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小的方塊,置于OCT膠中,-80℃保存。將肝組織用冰凍切片機切成6～10 μm厚度。油紅O染液中(加蓋),密閉染色10～15 min。甘油明膠封固,顯微鏡下觀察切片組織病理改變及拍照。

2 結果

2.1 克癀膠囊對小鼠一般狀態及肉眼肝臟形態的影響 對每組小鼠的大體外觀和肝臟外觀進行拍照,并用肉眼觀察組間差異。Ctrl組小鼠形體勻稱,體寬3～4 cm。HFHS組小鼠體形圓潤,肥胖,體寬5～5.5 cm;克癀膠囊治療組小鼠體寬約4 cm,各劑量組間肉眼觀察無明顯差異(圖1A)。Ctrl組小鼠肝臟呈暗紅色,質地柔軟。HFHS組小鼠肝臟體積較大、油膩,表面呈顆粒狀,肉眼可見黃白色局灶性脂肪沉積。克癀膠囊治療組小鼠肝臟呈暗紅色,體積顯著縮小,質地柔軟(圖1B)。動態檢測各組小鼠的體重,與Ctrl組小鼠相比,從第2周開始,HFHS組小鼠體重顯著升高(P<0.05)(圖1C)。與Ctrl組小鼠相比,HFHS組小鼠每日卡路里攝入量和體重顯著升高(P<0.01)。與HFHS組小鼠相比,各藥組小鼠進食總熱量及體重無差異(表2)。

圖1 各組小鼠一般狀態記錄 (A)小鼠大體外觀,(B)小鼠肝臟形態,(C)小鼠體重記錄

表2 各組小鼠進食總熱量及終末體重比較

2.2 克癀膠囊對小鼠肝臟指數的影響 與Ctrl組相比,HFHS組小鼠肝重顯著增加(P<0.01)。用藥治療8周后,各組小鼠肝重、脾重及肝體比無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 各組小鼠肝臟指數比較

2.3 克癀膠囊對小鼠肝臟TG含量的影響 與Ctrl組小鼠相比,HFHS組小鼠肝臟TG含量顯著升高(P<0.01),與HFHS組小鼠相比,KL,KM,KH組小鼠肝臟TG含量顯著降低(P<0.05,且對肝臟TG含量的改善作用具有劑量依賴性趨勢(表4)。

表4 各組小鼠肝組織TG含量比較

2.4 克癀膠囊對小鼠肝組織病理學影響 肝組織病理染色結果見圖2。H&E染色結果(200 ×)顯示,Ctrl組小鼠肝小葉結構清晰,肝索排列整齊;HFHS組小鼠肝細胞出現明顯的彌漫性腫脹、脂肪變性,胞漿內大小不一的脂滴,部分匯管區、小葉內可見炎細胞浸潤;克癀膠囊及OCA組小鼠肝索排列較整齊,胞漿內脂滴明顯減少,脂肪變性和炎性細胞浸潤均有所減輕,氣球樣變性較少見。同樣,克癀膠囊各用藥組小鼠的肝脂肪變性評分、小葉炎癥評分、氣球樣變化評分均顯著低于HFHS組小鼠(表5)。

表5 各組小鼠NAS評分比較

2.5 克癀膠囊對小鼠血清肝功能的影響 與Ctrl組小鼠相比,HFHS組小鼠血清ALT、AST活性均顯著升高(P<0.01);與HFHS組小鼠相比,KL組和OCA組小鼠血清ALT和AST活性顯著下降(P<0.05),KH組小鼠血清ALT活性顯著下降(P<0.05)(表6)。

表6 各組小鼠血清肝功能比較

肝組織油紅O染色結果(見圖3)。Ctrl組小鼠肝組織僅有少量油滴均勻散在分布于肝細胞胞漿內;HFHS組小鼠肝細胞結構腫脹明顯,肝細胞內呈彌漫性脂肪變性,肝細胞內見大量鮮紅色脂滴;與HFHS組相比,克癀膠囊各劑量組及OCA組小鼠脂滴數量及大小均顯著減少,散在分布于肝細胞胞漿內。

圖3 各組小鼠肝組織油紅O染色 染色觀察(200×)

2.6 克癀膠囊對小鼠血清脂質含量的影響 與Ctrl組小鼠相比,HFHS組小鼠血清TC,HDL-C,LDL-C含量顯著升高,FFA含量顯著下降(P<0.01)。與HFHS組小鼠相比,KL組小鼠血清TC,HDL-C含量均顯著下降,血清TG,FFA含量顯著升高(P<0.05);KM組小鼠HDL-C含量顯著下降(P<0.05)(表7)。

表7 各組小鼠血清脂質含量比較

2.7 克癀膠囊對小鼠糖代謝的影響 與Ctrl組小鼠相比,HFHS組小鼠FBG,FINS含量及HOMA指數均顯著升高(P<0.01);與HFHS組小鼠相比,KM,KH組小鼠FBG水平顯著下降(P<0.05)(表8)。

表8 各組小鼠胰島素抵抗狀態比較

3 討論

NAFLD尤其是在中心性肥胖、Ⅱ型糖尿病、血脂異常和代謝綜合征的患者中成為常見的慢性肝病之一。NAFLD人群普遍具有代謝綜合征特征,并伴有相關的心血管疾病危險因素[7]。大多數肝脂肪變性患者的疾病是“非進行性”的,但也有一小部分患者發展為的NASH, 進而導致肝硬化甚至肝細胞癌[3]。因此尋求有效的防治NASH的藥物十分重要。由于NASH是復雜的、系統性的疾病,這也提示針對單一靶點治療的藥物難以滿足該疾病的治療目標。中藥復方具有多種成分、多個途徑和多個靶點的作用特點,針對系統性疾病具有一定的優勢和前景。目前沒有FDA獲批的治療NASH的特定藥物,但是在臨床中,中醫藥廣泛應用于NASH的防治[8]。中醫認為NAFLD主要的病理基礎為痰、濕、瘀、積[9]。NAFLD的證型分布也提示痰濕內阻證,濕熱內蘊和痰瘀互結證是常見的證型[10]。因此靈活運用具有清熱利濕、活血散瘀功效的中藥方劑對NASH可有良好的改善作用。前期有動物實驗提示具有清熱利濕的經典名方三仁湯、活血化瘀功效的血府逐瘀湯等對NAFLD均有顯著的改善作用[11,12]?？笋ツz囊是一種已上市的中成藥,主要適用于脅肋脹痛或刺痛,脅下痞塊,口苦口粘,納呆腹脹,面目黃染,小便短赤,舌質黯紅或瘀斑、瘀點,舌苔黃膩,脈弦滑或澀等濕熱毒邪內蘊、瘀血阻絡證及急、慢性肝炎?？笋ツz囊中三七為君藥具有活血化瘀之功效,黃連、黃芩、黃柏等多味藥物具有清熱利濕之功效。選用克癀膠囊作為治療NASH的中成藥符合中醫臨床用藥的原則。

本研究結果表明克癀膠囊對HFHS誘導的NASH小鼠模型有較好的改善作用?？笋ツz囊在不影響NASH小鼠卡路里攝入總量的情況下,對于小鼠的體重增加有一定的抑制作用(P>0.05)。NASH是以肝臟脂質積累為主要特征的慢性肝臟疾病,改善肝臟脂質沉積是治療NASH的首要任務。低、中、高劑量(分別相當于臨床等效劑量的6.17、12.33、24.66倍)的克癀膠囊均可顯著地降低NASH小鼠的肝臟TG含量(P<0.05),改善NASH小鼠肝臟病理變化、NAS評分(P<0.05),且具有劑量依賴性趨勢。對于NASH小鼠的血清ALT、AST酶活性的影響,低劑量的克癀膠囊效果更為顯著(P<0.05);中劑量克癀膠囊可顯著改善血清HDL-C含量及FBG水平(P<0.05);而高劑量的克癀膠囊對降低小鼠血清ALT酶活性,血清TC、HDL-C、LDL-C含量及FBG水平效果更優(P<0.05)。這與之前高脂飲食誘導的NAFLD大鼠實驗結果類似[6],提示針對臨床NAFLD患者的異常指標,應調整最佳給藥劑量。值得注意的是,在動物實驗中觀察到低劑量的克癀膠囊給藥組小鼠血清中TG和FFA有升高情況,因此在后期臨床試驗中應密切關注患者的血脂情況。鑒于本次實驗以克癀膠囊對NASH小鼠的藥效學觀察為主,該藥的機制研究亟需進一步開展。

綜上,克癀膠囊低、中、高劑量組(0.5 g/kg、1 g/kg、2 g/kg),分別相當于臨床等效劑量的6.17、12.33、24.66倍,對高脂飲食高糖飲水誘導的小鼠NASH模型均具有不同程度的治療作用,可為該藥的臨床推廣應用提供實驗依據。