下丘腦/延髓軸調(diào)節(jié)創(chuàng)傷性顱腦損傷后外周脂質(zhì)代謝

費(fèi)茂星,李振興,羅詩(shī)樵,周夢(mèng)良,王漢東,3

1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院神經(jīng)外科,南京 210008; 2.南京醫(yī)科大學(xué),南京 211166; 3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬明基醫(yī)院神經(jīng)外科,南京 210019

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是神經(jīng)外科常見(jiàn)的急重癥之一,也是世界范圍內(nèi)青壯年死亡的最常見(jiàn)原因[1-2]。其中,自主神經(jīng)活性與能量代謝改變是導(dǎo)致TBI患者不良預(yù)后的重要原因,也是關(guān)系TBI患者營(yíng)養(yǎng)管理決策的重要因素。既往研究表明,較多TBI患者表現(xiàn)出交感神經(jīng)系統(tǒng)高反應(yīng)性,重者可表現(xiàn)為陣發(fā)性交感興奮[3]。TBI后交感神經(jīng)系統(tǒng)高反應(yīng)性是否與能量代謝異常相關(guān)有待進(jìn)一步探究。

既往研究表明,交感活性與下丘腦-延髓網(wǎng)絡(luò)連接改變存在密切的相關(guān)性[4]。下丘腦是調(diào)節(jié)全身能量代謝的重要部位,而下丘腦異常可通過(guò)激素調(diào)節(jié)等異常引起全身代謝紊亂[5-7]。延髓頭端中縫核(rostral medullary raphe region,rMR區(qū))及延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性、控制體溫心率等活動(dòng)的中樞部位,而下丘腦通過(guò)對(duì)該區(qū)域形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性[4]。因此,TBI后下丘腦-延髓網(wǎng)絡(luò)連接改變可能在TBI后脂代謝改變中起重要作用。

外周脂質(zhì)代謝在TBI后改變目前研究較少,肝臟及棕色脂肪是體內(nèi)脂質(zhì)代謝的重要參與者。TBI后肝臟及棕色脂肪出現(xiàn)何種變化仍需深入研究。同時(shí),下丘腦相關(guān)網(wǎng)絡(luò)能否介導(dǎo)TBI后交感興奮以及影響肝臟和棕色脂肪代謝,仍有待進(jìn)一步探索。在本研究中,筆者將針對(duì)TBI后下丘腦/延髓區(qū)域神經(jīng)元激活情況及外周脂質(zhì)代謝改變進(jìn)行檢測(cè),以探究?jī)烧咧g的相關(guān)性。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與TBI模型

本實(shí)驗(yàn)選用無(wú)特定病原體、周齡8周成年雄性C57BL/6小鼠,購(gòu)自集萃藥康生物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物預(yù)先被移入實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房并適應(yīng)1周,飼養(yǎng)期間小鼠自由進(jìn)水進(jìn)食,動(dòng)物房恒濕(45%～50%)恒溫(23～25 ℃),室內(nèi)燈光12 h明暗間隔循環(huán)模擬晝夜節(jié)律。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為Sham組、TBI-1 d組、TBI-3 d組、TBI-7 d組,每組6只,TBI組通過(guò)重物撞擊制作TBI模型:重物質(zhì)量為100 g,撞擊高度為3 cm,撞擊位置為前囟后方2 cm、右側(cè)旁開(kāi)2 cm[8]。Sham組進(jìn)行頭皮切開(kāi)縫合處理;于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死并留取相應(yīng)標(biāo)本。收集腦組織、棕色脂肪及肝臟標(biāo)本分別行Western blot及免疫熒光染色。

2 改良油紅O染色及免疫熒光染色

對(duì)留取的組織樣本使用多聚甲醛固定24 h,蔗糖梯度脫水后行冰凍切片。改良油紅O染色試劑購(gòu)于碧云天生物公司,油紅O染色具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。染色工作液染色20 min后,洗滌封片,然后鏡下觀察拍照、統(tǒng)計(jì)分析。

冰凍切片復(fù)溫后多聚甲醛固定15 min,磷酸鹽緩沖溶液(PBS)浸洗后Triton通透處理、山羊血清封閉,而后4 ℃一抗孵育過(guò)夜,含0.2% Tween 20的PBS(PBST)浸洗后孵育另一種一抗過(guò)夜,PBST浸洗后孵育對(duì)應(yīng)二抗。使用含DNA染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-Diamidino-2’-phenylindole,DAPI)抗熒光淬滅封片液封片,然后鏡下觀察拍照。

3 Western blot實(shí)驗(yàn)

對(duì)留取的腦組織樣本及肝臟樣本按照操作步驟提取蛋白,應(yīng)用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度,按蛋白濃度調(diào)整加樣量,根據(jù)分組順序進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳,電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至0.45 μm聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,4℃孵育一抗過(guò)夜,TBST清洗2遍后室溫孵育相應(yīng)二抗1 h。電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)顯示液浸潤(rùn)后于曝光儀器中拍照,后續(xù)通過(guò)Image J定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 TBI后棕色脂肪及肝臟脂滴含量改變

棕色脂肪是體內(nèi)熱量產(chǎn)生和能量代謝的重要場(chǎng)所,為檢測(cè)TBI后棕色脂肪脂質(zhì)代謝情況,筆者留取Sham組、TBI后3 d及7 d小鼠肩胛間區(qū)棕色脂肪,通過(guò)油紅染色確定細(xì)胞內(nèi)油脂大小(圖1a),通過(guò)分析油脂面積及相同視野下細(xì)胞數(shù)量反映棕色脂肪代謝情況(圖1b)。結(jié)果提示TBI后3 d及7 d肩胛間區(qū)棕色脂肪較Sham組明顯減少,同時(shí)TBI后單位面積內(nèi)細(xì)胞量明顯增多,提示TBI后棕色脂肪代謝活動(dòng)增強(qiáng)。

圖1 TBI后棕色脂肪及肝臟脂質(zhì)代謝改變。a.對(duì)Sham組、TBI-3 d組、TBI-7 d組肩胛間區(qū)棕色脂肪進(jìn)行改良油紅染色,顯微鏡鏡檢可見(jiàn)油脂相對(duì)面積在TBI造模后明顯減少;b.統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示相對(duì)脂滴面積/細(xì)胞數(shù),Sham組明顯較TBI組多,**提示P<0.01,比例尺為50 μm;c.對(duì)Sham組、TBI-3 d組、TBI-7 d組肝臟組織進(jìn)行PLIN2免疫熒光染色;d.統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示TBI組中PLIN2免疫熒光強(qiáng)度明顯增高,**提示P<0.01,***提示P<0.001,比例尺為25 μm。PLIN2:脂滴包被蛋白2

肝臟是能量代謝的中心部位,為進(jìn)一步明確肝臟脂質(zhì)代謝情況,對(duì)Sham組及TBI組肝臟組織使用脂滴包被蛋白2(perilipin 2,PLIN2)進(jìn)行冰凍切片免疫熒光染色(圖1c、d),結(jié)果提示TBI后肝臟細(xì)胞PLIN2陽(yáng)性顆粒較Sham組明顯增多。這些結(jié)果提示TBI后肝臟出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)代謝負(fù)擔(dān)增加。

2 肝臟脂噬增強(qiáng)

為進(jìn)一步明確肝臟脂質(zhì)代謝情況,收集Sham組、TBI-1 d、3 d、7 d組肝臟標(biāo)本提取蛋白后行Western blot檢測(cè)脂噬相關(guān)蛋白。結(jié)果提示,相較Sham組,TBI后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3Ⅱ出現(xiàn)明顯增加(圖2a、b)。為進(jìn)一步明確脂噬活動(dòng)是否增加,也對(duì)脂噬相關(guān)蛋白激素敏感性脂酶(hormone sensitive lipase,HSL)、甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果同樣提示HSL、ATGL在TBI組中出現(xiàn)增高(圖2a、b)。這一結(jié)果提示TBI后肝臟脂質(zhì)代謝活動(dòng)增加。

圖2 TBI后肝臟脂噬增強(qiáng)。a.對(duì)收集的肝臟標(biāo)本(Sham組、TBI-1 d、3 d、7 d組)進(jìn)行Western blot染色,檢測(cè)指標(biāo)包括自噬相關(guān)指標(biāo)(Beclin1、LC3B)、脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)(ATGL、HSL),內(nèi)參蛋白為β-actin;b.統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,相較對(duì)照組,TBI組Beclin1、ATGL、HSL不同程度增高,LC3BII/LC3BI比值在TBI-3 d及7 d也明顯增加。 ns差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,*P<0.05,**P<0.01。HSL:激素敏感性脂酶;ATGL:甘油三酯脂酶;LC3B:微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β

3 TBI后下丘腦神經(jīng)元激活

下丘腦是全身能量代謝重要的調(diào)節(jié)中樞,同時(shí)也是交感活動(dòng)重要的調(diào)控區(qū)域。為了明確TBI后下丘腦神經(jīng)元激活情況,通過(guò)對(duì)Sham組、TBI-3 d組腦組織切片行神經(jīng)元激活標(biāo)志蛋白c-Fos與NeuN免疫熒光共染;圖3結(jié)果提示,TBI組中下丘腦區(qū)與NeuN共定位c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增多,提示TBI后下丘腦區(qū)神經(jīng)元激活增多。

圖3 TBI后下丘腦神經(jīng)元激活。a.對(duì)Sham組、TBI-3d組腦組織下丘腦層面進(jìn)行切片c-Fos免疫熒光染色,b.鏡檢見(jiàn)TBI-3 d組中c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞較Sham組明顯增高。比例尺為25 μm。NeuN:神經(jīng)元胞核;c-Fos:FBJ骨肉瘤原癌基因蛋白

4 TBI后延髓區(qū)域神經(jīng)元激活

下丘腦-中縫核/延髓頭端腹外側(cè)區(qū)域是中樞交感活動(dòng)控制調(diào)節(jié)神經(jīng)通路,其交感信號(hào)可調(diào)控心肺活動(dòng)、棕色脂肪代謝及能量代謝過(guò)程。為進(jìn)一步研究該區(qū)域神經(jīng)元在TBI后變化,同樣對(duì)該區(qū)域冰凍切片標(biāo)本行c-Fos與NeuN共定位染色。結(jié)果提示,rMR區(qū)域在TBI-1 d及TBI-3 d c-Fos陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多(圖4a、b),RVLM區(qū)熒光染色結(jié)果也同樣提示在TBI組中該區(qū)激活神經(jīng)元比例增加(圖4c、d)。

圖4 TBI后延髓頭端腹外側(cè)區(qū)及中縫核神經(jīng)元激活。對(duì)Sham組、TBI-1 d組、TBI-3 d組腦組織延髓層面進(jìn)行切片行c-Fos免疫熒光染色,結(jié)果可見(jiàn)TBI組中rMR區(qū)(a、b)及RVLM區(qū)(c、d)c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增高。比例尺為50 μm。NeuN:神經(jīng)元胞核;c-Fos: FBJ骨肉瘤原癌基因蛋白。Merge為相融圖

5 單細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)果提示下丘腦POMC神經(jīng)元TBI后改變

下丘腦區(qū)POMC神經(jīng)元是全身能量代謝重要調(diào)節(jié)者,為進(jìn)一步研究該群神經(jīng)元在TBI后變化,通過(guò)對(duì)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中GSM5938054、GSE207078數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[9],該數(shù)據(jù)集包含Sham組、輕型TBI組(mTBI)及爆炸傷TBI組(bTBI)腦室下區(qū)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù),通過(guò)對(duì)POMC陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行提取(Sham組25個(gè)POMC陽(yáng)性細(xì)胞、mTBI組28個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞、bTBI組29個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞)。GO分析結(jié)果提示,相較于Sham組,mTBI及bTBI組中突觸重塑、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)釋放、激素分泌調(diào)節(jié)等功能明顯富集(圖5a、c);Snx10、Stat5b、Chrm3、Ncoa5、Kcnh7(mTBI組vs.Sham組)、Prkdc、Cspg5、Camk2d、Gabbr2(bTBI組vs.Sham組)等與代謝調(diào)控、激素信號(hào)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平增高(圖5b、d),提示POMC神經(jīng)元在TBI后功能活動(dòng)改變可能與TBI后全身能量代謝改變存在關(guān)聯(lián)。

圖5 TBI后下丘腦POMC神經(jīng)元改變。a.GO功能富集分析結(jié)果提示,相較Sham組,mTBI組POMC神經(jīng)元突觸功能、囊泡活動(dòng)、神經(jīng)遞質(zhì)分泌、激素調(diào)節(jié)等功能出現(xiàn)明顯富集;b.火山圖結(jié)果顯示Snx10、Stat5b、Chrm3、Ncoa5、Kcnh7等基因出現(xiàn)明顯變化;c.GO功能富集分析結(jié)果提示,相較Sham組,bTBI組POMC神經(jīng)元突觸功能、囊泡活動(dòng)、神經(jīng)遞質(zhì)分泌、激素調(diào)節(jié)等功能同樣出現(xiàn)明顯富集;d.火山圖結(jié)果顯示Prkdc、Cspg5、Camk2d、Gabbr2等基因出現(xiàn)明顯變化。Snx10:分選連接蛋白10;STAT5B:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子5B;Chrm3:膽堿能受體毒蕈堿3;Ncoa5:核受體輔激活因子5;Kcnh7:鉀電壓門(mén)控通道亞家族H成員7;Prkdc:蛋白激酶DNA活化催化亞基;Cspg5:硫酸軟骨素蛋白聚糖5;Camk2d:鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II,δ;Gabbr2:γ-氨基丁酸B型受體亞單位2

討 論

能量代謝改變是TBI患者面臨的重要問(wèn)題,在TBI急性期往往呈現(xiàn)負(fù)氮平衡及能量消耗狀態(tài)[10],因此,深入了解TBI能量代謝改變的病理機(jī)制對(duì)TBI后能量代謝管理具有重要意義。脂質(zhì)代謝不僅與全身能量供應(yīng)相關(guān),在全身炎癥狀態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)等活動(dòng)中也扮演重要作用,而TBI后外周脂質(zhì)代謝變化仍有待進(jìn)一步研究。本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)TBI后小鼠肩胛間區(qū)棕色脂肪脂滴面積出現(xiàn)明顯減少,提示TBI后棕色脂肪對(duì)脂質(zhì)利用增多。考慮到肝臟在脂質(zhì)代謝中的重要作用,進(jìn)一步對(duì)肝臟脂滴進(jìn)行熒光染色,結(jié)果提示肝臟脂滴在TBI后增加。這與既往研究結(jié)果一致[11],然而肝臟脂質(zhì)利用能力在TBI后是否發(fā)生改變?nèi)匀鄙傧鄳?yīng)闡述。因此通過(guò)對(duì)脂噬相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)TBI后肝臟脂噬蛋白增加,提示TBI后肝臟脂質(zhì)代謝增強(qiáng)。結(jié)合臨床TBI患者交感活性增加,筆者推測(cè)外周脂質(zhì)代謝改變可能與此有關(guān)。

下丘腦是人體能量代謝重要的調(diào)節(jié)中樞,在體溫、自主神經(jīng)節(jié)律、糖脂代謝調(diào)節(jié)等活動(dòng)中起到重要作用,其中下丘腦-延髓網(wǎng)狀連接是其調(diào)控信號(hào)傳遞的重要途經(jīng)[3]。在本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)TBI后下丘腦-rMR/ RVLM區(qū)神經(jīng)元激活,同時(shí)單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析結(jié)果提示TBI組中下丘腦POMC神經(jīng)元在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡分泌等活動(dòng)中出現(xiàn)明顯變化。TBI后交感興奮是較為明顯的表現(xiàn),其發(fā)生對(duì)患者生存質(zhì)量具有負(fù)面影響。考慮到下丘腦-rMR/ RVLM區(qū)神經(jīng)連接通路是交感調(diào)節(jié)通路重要結(jié)構(gòu),結(jié)合本研究中TBI患者交感活性增高,因此筆者推測(cè)TBI后該神經(jīng)通路的激活與臨床TBI患者出現(xiàn)的交感興奮癥狀存在密切相關(guān)性。

在目前的研究中,下丘腦相關(guān)神經(jīng)環(huán)路調(diào)節(jié)的中樞神經(jīng)交感信號(hào)在外周器官脂質(zhì)代謝活動(dòng)中具有重要的調(diào)控作用[12-13]。多項(xiàng)研究表明棕色脂肪受交感神經(jīng)直接調(diào)節(jié),離斷棕色脂肪交感神經(jīng)連接可顯著減少其脂質(zhì)代謝水平[14]。本研究中,TBI后棕色脂肪脂質(zhì)水平明顯減少,提示TBI后交感神經(jīng)興奮性增高可能是棕色脂肪脂質(zhì)利用增多的原因。

同樣,肝臟在TBI后脂代謝改變或許也與交感神經(jīng)興奮性增高密切相關(guān)。Torres等[15]通過(guò)對(duì)肝臟注射偽狂犬病病毒逆行性示蹤,結(jié)果提示肝臟接收來(lái)自腹腔-腸系膜上復(fù)合體與主動(dòng)脈和腎上神經(jīng)節(jié)的交感神經(jīng)投射。同時(shí)交感神經(jīng)激活可影響肝臟脂質(zhì)代謝,促進(jìn)低密度脂蛋白-甘油三脂的產(chǎn)生,并與肝臟脂肪變性密切相關(guān)[16]。在本研究中,筆者也觀察到,伴隨著TBI的中樞交感系統(tǒng)興奮,肝臟在TBI早期存在脂滴蓄積增加。然而,也同樣觀察到脂噬活動(dòng)增強(qiáng),提示肝臟脂質(zhì)代謝利用能力增強(qiáng)。本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)TBI后下丘腦-rMR/ RVLM區(qū)神經(jīng)元的激活與棕色脂肪、肝臟脂質(zhì)代謝活動(dòng)存在明顯的相關(guān)性,提示其在TBI后脂質(zhì)代謝改變中存在可能的調(diào)控作用,其臨床意義及具體作用機(jī)制仍有待深入研究。在未來(lái)研究中,筆者將進(jìn)一步對(duì)下丘腦-延髓軸進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)以明確TBI后中樞交感系統(tǒng)激活對(duì)全身脂質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)制。

在本研究中,筆者通過(guò)免疫熒光染色及單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)TBI后下丘腦-rMR/ RVLM區(qū)神經(jīng)元激活增加,可能通過(guò)增加交感系統(tǒng)高反應(yīng)性,促進(jìn)棕色脂肪脂質(zhì)代謝以及增加肝臟脂噬能力,提高肝臟脂質(zhì)代謝水平。本研究著重關(guān)注下丘腦/延髓交感系統(tǒng)激活情況與外周脂質(zhì)代謝相關(guān)性,為臨床TBI患者代謝改變提供理論支持,然而其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步揭示。

作者貢獻(xiàn)聲明：費(fèi)茂星:論文撰寫(xiě);李振興、羅詩(shī)樵:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;周夢(mèng)良、王漢東:思路設(shè)計(jì)及文稿修改