比較兩種固定液過度固定乳腺癌組織對FISH法檢測HER2基因的影響

繆 琛,賀 驍,韓 雪,宋國新

FISH技術常用于檢測和定位染色體上特定的DNA序列[1],有利于病理鑒別診斷[2]、指導臨床靶向用藥[3]和監(jiān)測腫瘤的復發(fā)[4]。組織標本的前處理對確保臨床檢驗結果的準確性尤為重要,固定是組織處理中最重要的環(huán)節(jié),也是整個制片過程中最無法補救的一步[5],組織過度固定或固定不足均會對檢測結果造成影響[6]。乳腺癌穿刺樣本,在離體后即加入固定液中保存,由于周末節(jié)假日等原因,部分樣本未能及時送至病理科,穿刺組織體積較小易出現(xiàn)固定過度,在制片中常存在消化難和雜交背景亮等問題。本科室在日常工作中摸索一種環(huán)保固定液在組織過度固定的情況下,比經(jīng)10%中性福爾馬林液過度固定組織染色效果好,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2023年5～6月我院病理科非特殊類型浸潤性乳腺癌30例標本,每例取大小2 mm×2 mm×5 mm的細長條狀癌組織2條,模擬乳腺穿刺組織,隨機分成2組,其中一組采用10%中性福爾馬林液固定,另一組采用環(huán)保固定液固定(南京天優(yōu)生物公司),分別固定72 h。

1.2 HE染色標本均經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水;蘇木精染細胞核,1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,飽和碳酸鋰水溶液返藍;伊紅著染細胞質,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,鏡檢。依據(jù)《臨床技術操作規(guī)范·病理學分冊》中的質控評分標準,對病理切片進行質量分級評定(表1)。

表1 病理常規(guī)石蠟包埋HE染色切片質量評分標準

1.3 FISH法(1)切片:石蠟組織固定后,脫水包埋,切片3～4 μm厚,置于防脫載玻片上。(2)烤片和脫蠟:70 ℃ 烤片1 h以上,再依次脫蠟至水。(3)修復:水浴煮沸25 min。(4)消化:胃酶工作液(2.5 mg/mL)于水浴鍋中37 ℃統(tǒng)一消化1 min。(5)洗片:將玻片置于2×SSC溶液中室溫漂洗2次,每次5 min;將玻片依次置于70%、85%、100%梯度乙醇中脫水各3 min,自然晾干。(6)添加探針:配置HER2基因探針(北京金菩嘉公司),移液器吸取10 μL滴于組織上,用蓋玻片封固。(7)變性和孵育:雜交儀上經(jīng)83 ℃變性10 min,于37 ℃過夜孵育。(8)洗片和復染:次日取出玻片,輕輕取下蓋玻片,防止損傷組織,70 ℃置于0.4×SSC溶液2 min;室溫2×SSC漂洗2 min后,置于70%乙醇溶液3 min,并于暗處自然晾干;每張切片加15 μL的DAPI復染,暗處靜置10 min后在熒光顯微鏡下閱片。

1.4 FISH消化時間驗證依照以上FISH實驗方法,將經(jīng)10%中性福爾馬林液過度固定組的中等片和差片分別消化5、10 min,探針雜交后觀察熒光染色效果。

1.5 結果判斷FISH檢測:當紅綠信號比值≥2.0或信號連接成簇時判為陽性;特殊情況下依據(jù)2019版《乳腺癌HER2檢測指南》進行判讀。(1)優(yōu)質:探針定位準確、信號強、核輪廓完整、背景熒光弱;(2)良好:探針定位準確、信號較強、核輪廓完整、但有少許背景;(3)中等:探針定位準確、信號弱、核輪廓欠完整、背景熒光強;(4)差:探針定位不準、信號弱、核輪廓不完整、背景強。染色優(yōu)良率=(優(yōu)質片數(shù)+良好片數(shù))/總片數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析,兩組間比較采用t檢驗,分類變量組間比較采用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組固定液HE染色比較依據(jù)HE染色切片質量標準和評分表進行評估,經(jīng)兩組固定液制片的切片HE染色均色彩艷麗,細胞核著色清晰,紅藍對比鮮明(圖1)。環(huán)保固定液組和10%中性福爾馬林液固定組HE染色評分均值分別為95.53、95.57分,兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

AB

2.2 兩組固定液HER2基因FISH檢測比較環(huán)保固定液組和10%中性福爾馬林液固定組FISH染色優(yōu)質切片分別為24、8張,良好切片分別為6、10張,中等切片分別為0、5張,差切片分別為0、7張,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表2)。實驗顯示:10%中性福爾馬林液固定組更易出現(xiàn)組織輪廓較模糊、背景熒光重和信號不明顯等問題,而環(huán)保固定液組的組織輪廓清晰完整、背景干凈、探針定位準確,可見耀眼的紅/綠熒光信號(圖2)。為了進一步驗證,延長消化時間能否改善10%中性福爾馬林液過度固定造成的背景熒光較重現(xiàn)象,本組對10%中性福爾馬林液固定組中等切片和差切片進行不同消化時間驗證,結果發(fā)現(xiàn)延長消化時間至5或10 min,均不能完全裸露細胞核、改善背景熒光較重的現(xiàn)象。

AB

表2 兩種固定液的HER2熒光染色評分

3 討論

病理工作中高質量的FISH切片應具有較強的熒光信號和較低的背景著色,以降低閱片難度,提高診斷的精確度[7]。

然而,如何獲得高質量的FISH切片是病理技術人員亟需解決的難題。乳腺穿刺組織、淋巴結穿刺組織等由于標本較小和送檢流程等問題,易導致組織固定時間過久影響FISH檢測。因此,探討一種對FISH檢測影響較小的固定方法非常重要。

10%中性福爾馬林過度固定的標本,為了消化出清晰的輪廓,延長消化時間至10 min,依然不能改善背景熒光重和信號不明顯等現(xiàn)象。已有研究表明,消化時間過長也會對細胞核有一定破壞,出現(xiàn)信號丟失的情況[6]。目前,環(huán)保固定液以醇溶結構為基礎固定效果較好,與10%中性福爾馬林液的交聯(lián)固定有本質區(qū)別[8]。文獻報道以醇溶為基礎固定的石蠟標本更有益于PCR檢測,并且長時間的固定對核酸質量影響較小,能有效避免過度固定[9]。因此,本組進一步分析環(huán)保固定液在FISH檢測HER2實驗中的應用效果,結果發(fā)現(xiàn)與10%中性福爾馬林液固定組相比,環(huán)保固定液組的HER2熒光信號清晰,背景干凈,細胞核輪廓完整清晰,易于閱讀診斷,用于FISH檢測更具有優(yōu)勢。

綜上所述,穿刺組織建議統(tǒng)一采取環(huán)保固定液固定,避免因為標本過度固定,影響基因檢測,該方法值得臨床推廣。