梨黑斑病拮抗菌的篩選研究

摘 要：本文以梨枝條、果實以及梨根際土壤為試驗材料，運用平板對峙法分離篩選出對梨黑斑病具有拮抗作用的菌株。結果表明：根際土壤中分離到可培養細菌8種，梨枝、梨果內分別分離到可培養菌株5種、3種；經過初步篩選得出共有7株對梨黑斑病菌有抑制效果的菌株，再經過復篩得出，7種菌株對梨黑斑病菌均有一定的抑制作用，但抑制效果不同，LZ d對梨黑斑病的拮抗作用最強，抑制率高達87%；其次是LT a和LT e，抑菌率為80.50%和83.25%；LG b和LT f的抑菌率為70.25%和78.50%；LZ e和LT h抑制效果最差，抑菌率僅為49.50%和55%。

關鍵詞：梨黑斑病；拮抗菌；生物防治；根際土壤

中圖分類號：S436.612.1+4 文獻標識碼：A DOI編碼：10.19440/j.cnki.1006-9402.2024.04.003

梨黑斑病菌可以侵染梨樹的果實、葉片和新梢[1]，給梨產業造成了巨大損失。目前常用化學防治，雖殺菌顯著，但化學農藥破壞生態，影響生物多樣，危害人體，制約農業發展。而生物防治優勢突出，能避免病菌產生抗藥性，安全高效經濟。據研究，梨黑斑病的主要病原種類是交鏈孢和細極鏈格孢，鏈格孢屬于真菌，寄生在植物上，引起植物發生病害[2]，郝金輝等人[3]分離篩選到的枯草芽孢桿菌可有效防治梨黑斑病且菌株能在梨果上定殖；王瀚等[4]人篩選得到了對核桃黑斑病病菌拮抗效果較好的細菌。本文篩選梨黑斑病菌的內生拮抗菌，為梨黑斑病菌生物防治提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 健康雪花梨：購自超市。健康梨植株根際土壤，健康梨樹枝條：采自健康梨果園。梨黑斑病菌：衡水學院生命科學系園林植物學試驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物組織微生物的分離 采用常規組織分離法。于超凈工作臺上，將新鮮梨樹枝條用75%酒精消毒30 s，20%次氯酸鈉消毒10 min，無菌水沖洗3次，晾干，用無菌解剖刀和鑷子挑取枝條韌皮部0.1 g，放入無菌研缽，加1 mL無菌水研磨后靜置。吸取研磨液上層200 L涂布于NA培養基平板，涂勻，重復3次，25 ℃培養3～5 d，觀察記錄菌落生長狀況[5]。將梨果實表皮去掉，用無菌鑷子挑取果肉置于NA培養基平板上，25 ℃培養3～5 d，觀察記錄菌落生長狀況。

1.2.2 土壤微生物的分離 梯度稀釋平板法。在河北衡水市梨園采集健康梨樹根際土壤樣品，先鏟開表層土，取10～15 cm深土壤裝入采集袋帶回實驗室置于4 ℃冰箱內備用。稱取5 g土樣，在滅菌超凈臺加5 mL蒸餾水依次制成10-1 、10-2 、10-3、10-4 、10-5濃度懸液，分別吸取10-3、10-4、10-5各100 L滴加到NA培養基平板，每個濃度重復3次，于25 ℃恒溫箱培養[5]。

1.2.3 拮抗菌的初篩 平板劃線法。于滅菌超凈工作臺上，將事先活化好的黑斑病菌用無菌打孔器（直徑8 mm）打取菌塊，取接種環在酒精燈上高溫消毒，然后在酒精燈旁冷卻，將已冷卻的接種環挑取菌種倒置于PDA平板中央，將接種環繼續灼燒冷卻，沾取純化好的菌落距離中心2 cm處均勻劃3次直線，重復上述過程完成其他菌種的篩選，并設置空白對照，于25 ℃恒溫培養箱中培養，3～5 d后觀察微生物對病原菌的抑制作用。

在超凈工作臺上，用無菌打孔器（直徑8 mm）取活化好的梨黑斑病菌落塊置于PDA平板中央，滅菌接種環沾取純化菌落距梨黑斑病菌落塊中心2 cm處劃3次直線[4，7]，設空白對照，25 ℃恒溫培養箱培養，3～5 d后觀察抑制作用。

1.2.4 拮抗菌復篩 采用平板對峙法。用無菌打孔器打取8 mm梨黑斑病菌菌塊置于PDA平板中心，干熱消毒鑷子夾取無菌濾紙片放于距菌餅2.5 cm處呈等邊三角形，用移液槍吸取測定細菌懸液浸濕濾紙片，每組重復3次，設空白對照（無菌水浸濕濾紙片）[5]；真菌拮抗性試驗用打孔器打取菌塊均勻置于梨黑斑病菌餅周圍，設3次重復和對照，25 ℃恒溫培養，48 h后開始觀察記錄抑菌帶寬度，直至對照長滿平板[3]。

平均抑制率/%=[（對照菌落直徑 - 處理菌落直徑）/對照菌落直徑]x100%

1.3 數據處理 用Excel 2019軟件對數據進行處理，用SPSS16.0軟件進行方差分析，差異顯著性水平為5%（p≤0.05）。

2 結果與分析

2.1 植物材料及根際土壤微生物分離結果

2.1.1 分離微生物的群落形態特征 經過3～5 d的培養觀察，初步選出16種菌落用于梨黑斑病拮抗菌的篩選，將菌落進行編號，分別為LZ a、LZ b、LZ c、LZ d、LZ e、LG a、LG b、LG c、LT a、LT b、LT c、LT d、LT e、LT f、LT g、LT h，其中LT a、LT e、LT f為真菌，其它都為細菌，于4 ℃保存備用。

2.1.2 植物微生物分離結果 由表1可知，果實中分離到微生物菌落數量為28個，菌種有較多重復，故根據菌落形態、顏色等特征的差別，經過篩選得出果實微生物中共有3種菌，并將其分別命名為LG a、LG b、LG c；枝條分離到微生物菌落數量為17，根據菌落形態、顏色等特征的差別，經篩選得出枝條微生物中共有5種菌，并將其命名為LZ a、LZ b、LZ c、LZ d、LZ e。

2.1.3 根際土壤微生物分離結果 由表2可知，根據不同濃度的土壤的菌落的形態、顏色、質地等特征的差別，共得到8種菌落，分別命名為LT a、LT b、LT c、LT d、LT e、LT f、LT g、LT h。

2.2 拮抗菌初篩結果 經過初篩觀察對比，共選出7種菌對梨黑斑病具有抑制效果，分別為LT a、LT e、LT f、LT h、LG b、LZ d、LZ e，其中LT h、LG b、LZ d、LZ e為細菌，其它3種為真菌。

2.3 拮抗菌復篩結果 對初篩選出的7株拮抗菌株進行復篩，通過測量第7 d的梨黑斑病菌抑菌帶寬度。

由表3可知，與對照組相比，7種菌種對梨黑斑病菌絲生長均有一定的抑制作用，但抑制效果不同。對試驗數據進行方差分析可知，抑制效果最好且穩定的是LZ d，抑菌率高達87%，LZ d與CK、LZ e、LT h之間抑菌率存在顯著性差異，但與LG b、LT a、LT e、LT f之間均無顯著性差異；其次，抑制效果較好的是LT a、LT e、LT f，它們與CK、LZ e之間存在顯著性差異，但與其他菌種之間均無顯著性差異； LZ e抑制效果最差，其平均抑菌圈寬度為（2.02±16） cm，抑菌率僅為49.50%，LZ e與LZ d、LT a、LT e、LT f之間均存在顯著性差異，但與CK、LG b、LT h之間無顯著性差異。

3 結論與討論

本試驗從健康梨果實、枝條、梨樹根際土壤中分別分離出了3、5、8種菌，經過初篩，共選出7種菌對梨黑斑病菌具有抑制效果，經過進一步定量篩選和分析，篩選出2種對梨黑斑病菌抑制效果好的菌，分別是從枝條和梨樹根際土壤中分離出的拮抗菌LZ d和LT e，抑制率高達87%和83.25%，這為進一步篩選梨黑斑病防治奠定了基礎。

后續可對拮抗菌的形態特征、生物學特性及分子生物學鑒定進行研究，同時研究可培養內生細菌和真菌以及根際土壤中微生物對梨黑斑病有拮抗作用的成分，分析是內生菌本身的生物學特性還是其代謝產物對梨黑斑病有抑制作用，明確其抑制機理。梨黑斑病的防治，需要綜合運用多種技術和方法，以減少病害對梨果產業的影響。隨著科技的進步，相信會有更多的微生物被分離出來，為植物病害的生物防治提供更多的選擇，為梨黑斑病綜合防治提供一種新的選擇。

參考文獻

[1] 段敏杰，伊洪偉，王 進，等．梨黑斑病抗病相關基因PpEMS1的克隆與分析[J]．生物技術通報，（下轉第13頁）（上接第8頁）2019，35（11）：16-21．

[2] 任美佳，張華平，鐘聰慧，等．庫爾勒香梨黑斑病病原鑒定[J]．石河子大學學報（自然科學版），2020，38（5）：574-579．

[3] 魯晏宏，郝金輝，詹發強，等．香梨黑斑病病原菌分離及拮抗菌篩選鑒定[J]．新疆農業科學，2022，59（10）：2 538-2 545．

[4] 王 瀚，卓平清，王讓軍，等．隴南核桃黑斑病病原菌拮抗菌篩選及鑒定[J]．經濟林研究，2018，36（1）：64-68+74．

[5] 王 紅．砂生槐內生細菌的分離鑒定及生防潛力研究[D]．林芝：西藏農牧學院，2021．

[6] 侯曉杰，梁魁景，叢日征，等．貯藏期蘋果輪紋病拮抗菌的篩選研究[J]．北方園藝，2015（23）：115-119．

[7] 謝 莉．梨黑斑病拮抗放線菌的選育及其抗菌物質研究[D]．石家莊：河北師范大學，2008．

收稿日期：2024-05-22

項目名稱：河北省濕地保護與綠色發展協同創新中心課題（2023XTCX001）；河北省現代農業產業技術體系建設專項目（HBCT2024170403）

第一作者簡介：梁魁景，碩士，講師，主要從事植物病蟲害生物防治工作。