桃樹黑星病菌生防菌的篩選及其防效研究

摘 要：采用平板對峙法和離體葉片防效法，測定從深州蜜桃果園發病植株的健康桃果實中分離篩選出生防菌株枯草芽孢桿菌SF-29對桃樹黑星病病原菌嗜果枝孢菌的抑制作用。結果表明：菌株SF-29能夠分泌胞外抑菌物質，對嗜果枝孢菌孢子萌發抑制率達到93.28%。

關鍵詞：桃樹黑星病；生防細菌篩選；病原菌抑制

中圖分類號：S436.621 文獻標識碼：A DOI編碼：10.19440/j.cnki.1006-9402.2024.04.005

深州蜜桃鮮嫩多汁，汁甜如蜜，在國內外享有盛譽[1]。桃黑星病是桃樹常見的主要病害之一，我國各桃產區均有發生。前期果實小，病斑不易被發現。由于該病的危害，常使果品質量變劣，嚴重影響桃的經濟效益。除侵染桃外，還能侵害李、杏等核果類果樹。

細菌是一種重要的生防物質，也是一種極具應用前景的生防劑[2]。本研究以深州蜜桃為對象，進行了黑星病生防菌的篩選及生防效果評價，以期為深州蜜桃的生物防治提供理論依據和生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料 供試菌株：桃樹黑星病病菌（嗜果枝孢菌）分離自深州蜜桃病害果實，并保存于衡水學院微生物實驗室；生防菌分離自蜜桃園發病植株的健康桃果實。

供試培養基：PDA培養基、NA培養基、LB液體培養基、無機鹽培養基。

儀器：生化培養箱SPX-150B-Z，高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-50A，超凈工作臺BJ-2CD，紫外分光光度計T9CS；冰箱BCD-226TX，TS-211B臥式振蕩培養箱。

1.2 方法

1.2.1 生防細菌分離與純化 生防菌分離與純化參照劉旭等[3]的方法進行。2021年10月從染病植株上隨機選取健康桃果，用自來水清洗，然后在消毒工作臺上用消毒過的濾紙吸干；再用70%乙醇沖洗40 s，0.9%次氯酸鈉沖洗10 min，最后用無菌水沖洗4～5遍。用最后1次的清洗液作為對照組（200 ul），涂于NA板上，置28 ℃恒溫培養箱內培養3～5 d，如果沒有菌生長，則說明組織表面已無菌。將5 g已完全消毒的桃果原料放置在裝有少許石英沙的滅菌研缽中，碾磨直到成漿狀，添加1 mL無菌水，放置15 min，將上清物稀釋到3個濃度梯度10-1，10-3，10-5，每濃度取1 mL涂布于NA平板上，重復3次，置于28 ℃培養箱中培養3～5 d。選取單個菌種進行純化，以作試驗用菌種。

1.2.2 生防細菌篩選

1.2.2.1 平板對峙法 取28 ℃黑暗培養3 d的病原菌，打取菌落邊緣菌盤（d=5 mm），放置于PDA平板中心，以待測微生物為接種物，置于病原菌兩側3 cm處平行劃線培養，28 ℃，培養4 d，測定抑菌圈的寬度，篩選抑菌效果較好的菌株進行后續研究[3]。

1.2.2.2 離體葉片防效試驗 嗜果枝孢菌孢子懸浮液的制備[4]：以桃果園為材料，收集受病菌侵染的新葉片，送至實驗室，用水漂洗，用無塵棉包好葉柄，放入裝有潮濕濾紙的平板上，20 ℃保濕培養2 d。用無菌刷子把病斑上的分生孢子刷到無菌水里制成孢懸液，然后以2 000 r/min，離心15 min，離心3次，然后用去離子水進行稀釋，得到8€？05 cfu/mL的孢懸液，待用。

生防菌發酵液配制：將生防菌接種于100 mL滅菌的 NA培養液中，28 ℃，120 r/min，培養48 h。得到的發酵液用無離子水稀釋至108 cfu/mL孢懸液，備用。

選擇健康、長勢均勻的桃葉，無菌水清洗后，用無菌棉花蓋上葉柄，葉背向上，放在鋪有濕潤濾紙的培養皿中。1個培養皿放1片葉子，1片葉子為1重復，10次重復。葉片接種嗜果枝孢菌懸液（8€？05 cfu/mL），24 h后葉片噴1種待測生防菌懸浮液（108 cfu/mL），以無菌清水為對照，用一種封閉的薄膜將培養皿密封。光照和黑暗12 h交替，28 ℃保濕培養7 d。統計葉片發病情況，篩選出防治桃瘡痂病害效果較好的生防菌。

病情指數=Σ（各級別發病葉數×相應等級）/（調查 葉片總數×9）×100;防治效果/%=（對照病情指數-處理 病情指數）/對照病情指數×100%。

0級表示，不帶病斑；1級，發病范圍不超過全葉5%；3級，發病范圍為全葉的6%～25%；5級，發病范圍可達26%～50%；7級時，發病區域達51%～75%；9級時，發病范圍超過76%，發生在全葉。

1.2.3 生防細菌鑒定 對所篩選到的生防菌進行革蘭染色和顯微鏡下的形態學分析[5]。

1.2.4 生防菌株SF-29抑制嗜果枝孢菌分生孢子萌發的試驗 生防菌株SF-29無菌發酵濾液的制備：按1%、3%、5%、7%、9%的接種量分別接種于LB培養液中制備發酵液。用0.22 €祄的濾膜過濾發酵液，獲得無菌發酵液，待用。將該菌株制成菌懸液（在500倍顯微鏡下可見25個孢子）與嗜果枝孢菌孢懸液配制成生防菌發酵液濃度為0、50、100、300、500 mL/L的混懸液，3次重復，以清水作對照，28 ℃，保濕培養8～10 h。觀察嗜果枝孢菌分生孢子萌發情況（芽管大于孢子的最小直徑，判定為萌發）［6］。

1.2.5 生防菌株SF-29抑菌物質的提取及對嗜果枝孢菌的抑菌活性 生防菌SF-29接種于LB培養液中，28 ℃，150 r/min震蕩24 h，發酵液經10 000 r/min離心20 min，除去菌體，上清液添加不同的硫酸銨，硫酸銨飽和度分別為10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，在4 ℃，放置24 h，棄上清，沉淀用25 mmol/L磷酸緩沖液溶解，分析脫鹽后，用濾紙片法[7]測定對嗜果枝孢菌的抑菌圈大小。以LB培養液為對照。

1.3 數據分析 采用SPSS18.0軟件、Duncan＇s方法及One-Way ANOVA 對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 生防細菌分離與篩選 從深州蜜桃果實中共分離得到48株細菌。通過平板對峙法和離體葉片測定分離到的細菌。結果表明：篩選到7株細菌能有效地抑制桃瘡痂病菌（見表1）。平板對峙法測定SF-29的抑菌帶寬度最大，為25.31 mm，SF-29離體葉片防治效果最好，達到98.46%，因此，所篩選到的細菌SF-29為最優生防細菌。

2.2 生防細菌SF-29的鑒定 生防細菌SF-297菌落形狀橢圓形、表面紋狀皺褶、凸起、有黏液不整齊，不透明、顏色為白色。SF-29菌株革蘭氏反應陽性，直、小短桿，芽孢橢圓形。

生防細菌SF-297生理生化性質由表2可知，甘露醇、木糖、檸檬酸鹽等為陽性反應；纖維二塘、葡萄糖等為陰性反應。

2.3 生防細菌與化學藥劑抑制嗜果枝孢菌孢子萌發的對比效果

2.3.1 生防細菌SF-29抑制嗜果枝孢菌孢子萌發的效果 生防細菌SF-29抑制嗜果枝孢菌孢子的萌發（如圖1）。不同接種量對嗜果枝孢菌孢子萌發的效果不同，接種量3%、SF-29無菌懸液與嗜果枝孢菌孢子懸液配比為500 mL/L時，嗜果枝孢菌孢子萌發抑制率達到93.28%。依次增加接種量分別為4%、5%時，嗜果枝孢菌孢子萌發抑制率略有提高，分別為95.72%、96.39%。綜合考慮，采用3%的接種量。

2.4 生防細菌SF-29抑菌物質的提取及對嗜果枝孢菌的抑菌活性 從表3可以看出，在硫酸銨濃度為10%～35%時，對嗜果枝孢菌都有抑制作用，硫酸銨濃度為30%時，所提取的化合物具有較強的抑制作用，抑菌圈直徑達46.23 mm。

3 結論與討論

本研究采用平板對峙法和離體葉片法，測定從深州蜜桃果園發病植株的健康桃果實中分離篩選出的48株細菌對桃樹黑星病的防治效果。結果表明：SF-29在發酵過程中產生了大量的外源抑菌物質，硫酸銨濃度為30%時，所提取到的物質對嗜果枝孢菌的抑菌圈直徑達46.23 mm，接種量3%、SF-29無菌懸液與嗜果枝孢菌孢子懸液配比為500 mL/L時，對嗜果枝孢菌孢子萌發抑制率達到93.28%。

生防菌枯草芽孢桿菌是一類普遍分布于自然環境中的無病原微生物，可分泌大量具有抑菌活性的多肽，對革蘭氏陽性微生物具有抑制作用，對霉菌，革蘭氏陰性微生物及酵母等也具有抑制作用［8］。

本研究所篩選到的SF-29對桃樹黑星病菌嗜果枝孢菌具有較強的抑制作用，為桃黑星病的生物防治提供理論依據和生防菌資源。

參考文獻

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