WNT3A結合并穩定FZD2激活Wnt通路促進成骨細胞增殖和分化的分子機制研究

崔永建, 李 艷, 王巧梅, 唐 慶

(新疆醫科大學第六附屬醫院, 新疆 烏魯木齊 830002)

骨質疏松癥(Osteoporosis,OP)的定義為髖部骨密度(bone mineral density,BMD)T評分為-2.5或更低[1]。OP(即“多孔骨”)會增加骨骼脆性和骨折的易感性。OP影響全球2億女性,每年導致890多萬例骨折。一半的絕經后婦女在其一生中發生過至少一次OP相關骨折[2]。盡管安慰劑對照試驗表明,雷洛昔芬可減少婦女椎體骨折,但雌激素類似物治療OP與腦血管意外和靜脈血栓栓塞的風險增加有關,國際標準治療指南因此建議不使用雌激素類似物[3]。而指南推薦的藥物包括雙膦酸鹽、地諾單抗和特立帕肽等,與安慰劑組相比,可將骨折的相對風險降低至0.40～0.60。然而長期服用上述藥物,仍存在不確定的潛在風險[4]。隨著社會老齡化加劇,未來對更為安全有效、可長期服用以治療OP預防骨折的新藥物的需求持續增加。臨床組織病理學能夠觀察到年齡相關性OP患者骨形成減少和骨髓脂肪積累增加。骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化而非向成骨細胞分化,在一定程度上導致了OP[5]。經典Wnt(the wingless/int1)信號通路促進成骨細胞分化和骨形成。Wnt信號通路的激活是由配體、受體和共受體的結合決定的。WNT3A等配體可與七次跨膜受體蛋白Frizzled(FZD)家族成員形成復合物,再結合單次跨膜共受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6,LRP5/6),以激活經典Wnt信號通路,并介導包括個體發育、成骨分化、骨形成等在內的多個過程[6]。WNT3A是多種潛在的、具有改善OP骨密度的藥物的作用靶點。如冬凌草苷(oridonin)是一種改善免疫力、維持免疫系統平衡、改善組織微循環的中藥有效化合物。它可通過上調WNT3A/β-catenin信號通路促進血管發生和骨組織供血,改善OVX小鼠骨密度[7]。FZD2是Frizzled(FZD)家族成員,是一種重要的Wnt信號通路受體蛋白。已報道的關于FZD2的病理生理學功能主要是激活經典Wnt/β-Catenin信號通路,介導腫瘤細胞上皮-間質轉化等促進腫瘤發生、發展的過程。但最近研究發現FZD2雜合突變通過WNT經典和非經典信號通路兩種方式導致人類胚胎肢體和顱面骨骼顯性發育不良,這種遺傳病被稱為Robinow綜合征和2型顯性發育不良(OMOD2)。說明FZD2至少對于個體胚胎發育過程中的肢體發育至關重要[8]。然而FZD2的基因突變或表達下調是否參與骨質疏松癥的致病機理,或者FZD2的表達可在治療中發揮保護功效,尚未有深入研究。在本研究中,首先通過對雌二醇(17β-Estradiol,E2)治療OVX誘導的OP小鼠模型后,其后肢脛骨中Wnt信號通路相關配體和受體表達水平的測定,探討配體WNT3A通過穩定和激活FZD2增加成骨細胞骨形成的活性和分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料:24只雌性6～8周齡C57BL/6J小鼠,體質量23±2g,購自新疆醫科大學實驗動物中心。小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1購自武漢普諾賽生命科技有限公司(中國)。腺病毒pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP載體購自上海和元生物(中國),腺病毒顆粒包裝也委托其代為完成。shRNA-FZD2和shRNA-NT由上海生工生物(中國)設計和合成。一抗:抗WNT3A多抗(貨號PA5-87468)、抗FZD2多抗(貨號38-4700)、抗Active-β-Catenin和β-Catenin多抗(貨號71-2700)、抗ALP多抗(貨號PA5-106391)、抗Runx2多抗(貨號PA5-82787)、抗磷酸化(phospho-,p-)STAT3單抗(貨號12-9033-42)、抗STAT3多抗(貨號PA5-84386)、抗p-JAK2 (Tyr119)多抗(貨號PA5-105889)、抗JAK2多抗(貨號44-406G)、抗泛素(ubiquitin,Ub)多抗(貨號PA3-16717)和抗β-actin多抗(貨號PA5-78715)購自Thermo Fisher Scientific(美國)。山羊抗兔IgG二抗(貨號XY0650)購自上海信裕生物(中國)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)細胞增殖能力測定試劑盒(貨號KTC011001)湖北艾美捷生物科技有限公司(中國)。

1.2方 法

1.2.1實驗動物:C57BL/6J小鼠飼養于22±3℃恒溫、45%～65%恒濕、配備12h/12h光照/黑暗循環的SPF級實驗動物房。小鼠喂食標準嚙齒類飼料,可以自由取食和飲水。每6只小鼠一個鼠籠。對小鼠實施OVX誘導OP之前,先適應性飼養一周。所有動物實驗均經我院倫理委員會批準。

1.2.2雙側卵巢摘除術(OVX)誘導建立OP小鼠模型:小鼠手術前禁食12h。手術開始前對小鼠施以2%異氟烷麻醉。向小鼠皮下注射克林霉素(45μg/g體重)預防手術感染。將小鼠俯臥位置于37℃恒溫加熱墊上并固定,剔除背部毛發并消毒皮膚。用無菌手術刀在小鼠背部肋弓向下1cm的脊柱側面1cm處切開一個切口,暴露腹腔。撥開性腺周圍脂肪組織,找到卵巢,然后結扎雙側卵巢周圍的血管并摘除雙側卵巢。逐層縫合傷口。假手術(Sham)組僅實施背部脊柱側面切口和縫合。小鼠手術后連續3d向其飲用水中添加曲馬多(25mg/L)進行鎮痛。手術后監測小鼠死亡和恢復情況,并繼續飼養7周誘導OP。

1.2.3動物實驗分組和處理方式:24只小鼠隨機分為4組,每組6只。對照(Control)組,對小鼠不做任何處理。假手術(Sham)組,僅對小鼠實施背部脊柱側面切口和縫合。OVX組,對小鼠實施OVX并連續飼養7周誘導建立OP小鼠模型。OVX+E2 Treatment組,誘導建立OP小鼠模型后,腹腔注射給予小鼠雌二醇(E2)(10μg kg/day),連續治療6周。結束后采用頸椎脫臼法處死小鼠。

1.2.4Western blot:處死小鼠,立即解剖獲取小鼠左、右后肢脛骨,剔除肌肉和結締組織,將脛骨浸沒于EDTA溶液中,在4℃冷室中脫鈣處理滿2周。加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,在液氮中研磨制備骨組織勻漿。在完成SDS-PAGE凝膠電泳和半干電轉印后,使用5%脫脂奶粉對PVDF膜進行封閉,室溫1h。向膜上滴加一抗工作液,4℃孵育過夜。次日,向膜上滴加二抗工作液,室溫孵育1h。抗體工作液稀釋度如下:抗WNT3A一抗(稀釋度1∶1500)、FZD2一抗(稀釋度1∶1000)、Active-β-Catenin和β-Catenin一抗(稀釋度1∶1500)、ALP一抗(稀釋度1∶2000)、Runx2一抗(稀釋度1∶1500)、p-STAT3(稀釋度1∶1000)、STAT3(稀釋度1∶1500)、p-JAK2(稀釋度1∶1000)、JAK2(稀釋度1∶1500)和β-actin一抗(稀釋度1∶2000);山羊抗兔IgG二抗(稀釋度1∶8000)。使用超敏ECL化學發光液顯影目的條帶。

1.2.5細胞培養:MC3T3-E1細胞培養于添加10%胎牛血清的DMEM培養液中,置于37℃恒溫、濕潤、通入5% CO2的細胞孵育箱中維持培養。

1.2.6免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation,co-IP):向處于指數生長期的MC3T3-E1細胞中加入WNT3A(5nmoL/L)處理6h,然后進行co-IP測定。使用冰預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次,然后加入免疫沉淀裂解緩沖液(20 mM Tris-HCl pH7.5,150 mM NaCl,1mM EDTA,10μM/mL 100×Halt蛋白酶,磷酸酶抑制劑混合物)裂解細胞。4℃,10,000 ×g離心5min,取上清液。加入偶聯有抗IgG抗體(1μg)或抗泛素(ubiquitin,Ub)抗體(1μg)的Protein A-Sepharose至全細胞裂解物上清液中,置于4℃下緩慢攪拌孵育過夜。次日,向Protein A-Sepharose-蛋白質復合物沉淀中加入3×SDS樣品緩沖液,在37℃下孵育5min解離蛋白質。然后使用抗FZD2抗體(稀釋度1∶1000)或抗Ub抗體(稀釋度1∶2000)或抗β-actin抗體(稀釋度1∶1500)進行免疫印跡(Immuno blot,IB)檢測。

1.2.7構建腺病毒-shRNA-FZD2載體和轉染:使用腺病毒pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP載體構建腺病毒-shRNA-FZD2載體或其對照組腺病毒-shRNA-NT載體。shRNA-FZD2:5’-CCTCATGAACAAGTTCGGTTT-3’,shRNA-NT:5’-CCGGCTCACTGGTCTCCACTC-3’。委托上海和元生物代為進行腺病毒顆粒包裝。種2.5×105細胞于6孔板中,待其貼壁培養過夜。次日,向MC3T3-E1細胞中加入WNT3A(5nmoL/L)處理6h后,更換細胞培養液為含6μg/mL polybrene和腺病毒顆粒(1×109PFU /mL,10μL)(腺病毒-shRNA-FZD2或腺病毒-shRNA-NT)的新鮮培養液,處理細胞4h。再次更換回新鮮的含10%胎牛血清的完全DMEM培養液,連續培養48h后采用Western blot法測定其對FZD2的敲低效率。

1.2.8Cell Counting Kit-8(CCK-8)細胞增殖能力測定:使用CCK-8細胞增殖能力測定試劑盒進行測定。具體實驗操作按照試劑盒說明書中的指導進行即可。

2 結 果

2.1E2治療的OVX小鼠脛骨組織中WNT3A和FZD2水平均上調:如(圖1A)所示,與Sham組相比,OVX組小鼠脛骨組織中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2表達水平均被下調(P<0.05);與OVX組相比,OVX+E2 Treatment組小鼠脛骨組織中上述蛋白因子的表達水平均被上調(P<0.05)。Sham組與Control組相比,小鼠脛骨組織中上述蛋白因子的表達水平無統計學差異(P>0.05)。

圖1 小鼠脛骨組織中成骨分化相關蛋白因子表達水平測定

2.2WNT3A處理增加MC3T3-E1細胞中FZD2的表達并促進細胞增殖和分化:如(圖2A)所示,與Control組相比,WNT3A Treatment組MC3T3-E1細胞中FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表達水平均升高(P<0.05)。如(圖2B)所示,與Control組相比,WNT3A Treatment組MC3T3-E1細胞增殖能力增強(P<0.05)。

圖2 WNT3A處理后MC3T3-E1細胞中成骨分化相關蛋白因子表達水平測定。

2.3WNT3A處理增加MC3T3-E1細胞中FZD2的穩定性:如(圖3A-左圖和右圖)所示,在Input對照組中,WNT3A處理(-/+)的MC3T3-E1細胞中FZD2和Ub的表達,IB檢測均為陽性;且與WNT3A處理(-)的細胞相比,WNT3A處理(+)的細胞中FZD2的表達水平升高(P<0.05)。如(圖3A-中圖和右圖)所示,在WNT3A處理(-)的IP:IgG對照組中FZD2和Ub的表達,IB檢測均為陰性;在IP:Ub組中,與WNT3A處理(-)的細胞相比,WNT3A處理(+)的細胞中FZD2的表達水平升高(P<0.05)。

圖3 對MC3T3-E1細胞給予WNT3A處理(-/+)后,免疫共沉淀檢測FZD2和Ub的直接相互作用。

2.4敲低-FZD2抑制WNT3A處理引起的MC3T3-E1細胞向骨合成代謝方向分化:如(圖4A)所示,與WNT3A Treatment組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表達水平均降低(P<0.05)。與WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-NT組上述蛋白因子表達水平均升高(P<0.05)。

圖4 敲低FZD2后WNT3A處理的MC3T3-E1細胞中成骨分化相關蛋白因子表達水平測定。

2.5敲低-FZD2抑制WNT3A處理引起的MC3T3-E1細胞的增殖:如(圖5A)所示,與WNT3A Treatment組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組p-STAT3和p-JAK2的磷酸化水平均降低(P<0.05);而2組細胞中STAT3和JAK2的表達水平無統計學差異(P>0.05)。與WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-NT組上述蛋白因子的磷酸化水平均升高(P<0.05);而2組細胞中STAT3和JAK2的表達水平無統計學差異(P>0.05)。如(圖5B)所示,與WNT3A Treatment組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組細胞增殖能力降低(P<0.05);與WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-NT組細胞增殖能力增強(P<0.05)。

圖5 敲低FZD2后WNT3A處理的MC3T3-E1細胞中細胞增殖相關信號和增殖能力測定。

3 討 論

對于OP的治療,目的是維持正常的骨量,其途徑包括抑制骨吸收或促進骨合成代謝。目前,抑制骨吸收的藥物種類較多,而促進骨合成代謝的藥物較少,后者還有很多藥物開發的策略有待深入探索。Wnt信號在決定骨髓間充質干細胞命運、增殖和分化中是必不可少的。Wnt信號包括經典的β-catenin依賴性信號(Wnt/β-catenin)和β-catenin非依賴性信號。其中Wnt/β-catenin信號通路是通過配體與一個7次跨膜卷曲蛋白(Frizzleds,FZDs)受體以及輔助受體LRP5/6結合,以阻止β-catenin的磷酸化和降解,從而激活β-catenin信號。未磷酸化并被激活的β-catenin將轉運至細胞核中,決定MSCs的分化命運。許多證據表明,Wnt/β-catenin信號轉導具有促成骨細胞前體細胞分化和抗脂肪細胞分化的作用。Wnt/β-catenin信號在維持骨量中起著關鍵作用。如Wnt/β-catenin信號通過激活成骨分化關鍵轉錄因子Runx2(runt-related transcription factor 2)/osterix(Sp7)促進MSCs向成骨細胞分化。與此同時,Wnt/β-catenin/Runx2也是抑制MSCs向脂肪細胞分化的關鍵信號。MSCs中Runx2表達缺失會引起PPARγ的表達上調并介導MSCs轉為向脂肪細胞分化。出生后Runx2表達缺失將導致小鼠骨量降低和骨組織中脂肪細胞積累[9]。

WNT3A屬于Wnt/β-catenin信號通路配體,促進骨形成。局部給予WNT3A治療可恢復骨髓炎手術清創后大段骨缺損的骨再生。在絕經后OP小鼠模型中WNT3A參與改善骨重塑增強小鼠骨骼的機械負荷和血管生成[10]。說明WNT3A作為促進骨形成的配體,在改善骨密度方面具有顯著效果。在本次研究結果中也顯示,與Sham組相比,OVX小鼠模型(OVX組)WNT3A表達下調;而與OVX組相比,陽性治療組(OVX+E2 Treatment組)中WNT3A表達被明顯上調。FZDs是7次跨膜細胞表面受體,歸屬于G蛋白偶聯受體超家族,并且與其他類別G蛋白偶聯。FZDs被Wnt家族配體激活后,介導調控胚胎發育、干細胞分化、器官發生和模式形成等重要生理學過程[11]。并在維持成人機體組織穩態、再生、可塑性和修復中起著至關重要的作用[8]。哺乳動物具有10種FZDs,FZD2是其中一員。FZD2對于胚胎的肢體發育至關重要,FZD2基因雜合型點突變就可以顯性方式致胚胎肢體和顱面骨骼發育缺陷[8]。之前未有報道在OP中FZD2的表達情況。而在本次研究結果中發現,與Sham組相比,OVX小鼠模型(OVX組)FZD2的表達水平被抑制;而與OVX組相比,陽性治療組(OVX+E2 Treatment組)中FZD2的表達水平被明顯增強。雖然這一結果尚未在OP患者低骨密度的骨骼中進行驗證,但在OVX小鼠模型水平上發現了WNT3A和FZD2的這一特殊的表達模式。

ALP(Alkaline phosphatase,堿性磷酸酶)在礦化組織細胞中高度表達,在硬組織的形成中起著至關重要的作用。ALP增加無機磷酸鹽在局部的沉積,促進礦化,并降低細胞外焦磷酸鹽(骨骼礦化抑制劑)。骨骼礦化是羥基磷灰石晶體從增生性成骨細胞和軟骨細胞的外膜萌發,在基質囊泡內產生,并在膠原原纖維之間積聚,參與形成骨骼細胞外基質。

在本研究結果中顯示,與OVX組相比,OVX+E2 Treatment組小鼠脛骨組織中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、Runx2和ALP表達水平均上調。說明WNT3A和FZD2參與了E2促進OP骨合成代謝的分子機制。更為重要的是,在本研究中發現配體WNT3A與FZD2結合并上調FZD2的水平可促進MC3T3-E1細胞的增殖和向骨合成代謝方向分化,上調Runx2和ALP。隨后對這一過程的分子機制研究發現,WNT3A處理可穩定細胞中FZD2免于進入泛素化降解途徑。可以看出WNT3A具有促進骨合成代謝的重要活性。但是在這些過程中,與此配體作用的關鍵受體仍未確定。在本研究中發現敲低FZD2抑制WNT3A處理引起的MC3T3-E1細胞的增殖和促骨合成代謝活性。這是一項重要的發現,由此可知介導配體WNT3A的促成骨分化活性和促骨合成代謝活性的重要細胞表面受體為FZD2。STAT3/JAK2信號是細胞重要的促存活、促增殖信號。敲低-FZD2抑制了WNT3A處理引起的MC3T3-E1細胞的增殖能力,以及p-STAT3和p-JAK2的磷酸化水平。這也進一步佐證了配體WNT3A是與FZD2結合后介導發揮其促進成骨細胞增殖和骨形成活性的。

總之,在本研究中雖然尚未深入探討單純過表達FZD2是否能夠起到促進骨合成代謝的功效。但基于本研究目前的結果可知,WNT3A的促骨合成代謝活性是通過結合并穩定FZD2激活Wnt/β-Catenin信號通路實現的。