METTL3調控miR-126介導TGF-β/Smad信號通路影響糖尿病腎病的機制研究

張 靜, 任 榮, 帕提古麗·阿斯討拜

(新疆醫科大學第五附屬醫院腎病科, 新疆 烏魯木齊 830011)

糖尿病腎病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病常見的微血管并發癥,是世界范圍內導致終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的重要原因之一[1]。表觀遺傳因素在DKD的進展中起到重要作用[2]。N6-甲基腺苷(m6A)是最豐富的RNA內部修飾,甲基轉移酶樣3 (Methyltransferase-like 3,METTL3)構成 m6A甲基轉移酶復合體的核心組分,負責催化 RNA 發生 m6A 修飾[3]。已有研究表明,METTL3參與DKD的進程[4]。進一步研究發現METTL3可以通過調控miRNA在DKD的發病機制中發揮重要作用[5]。其中miR-126參與了DKD的發生發展[6]。但關于METTL3與miR-126在DKD中的調控機制尚不明確。研究因此,本次研究擬通過建立糖尿病腎病大鼠模型,以METTL3為切入點,探討METTL3調控miR-126影響糖尿病腎病發生發展的機制研究,為臨床 DKD 的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1試驗動物:SD大鼠,體重(300±20)g,雌雄各半,6～8周齡。動物來源湖北省實驗動物中心。動物質量合格證編號:42000600048916,SCXK(鄂)2022-0065,倫理證明編號為202220159。

1.2試驗試劑:尿素氮(BUN)含量檢測試劑盒,Solarbio,中國;尿蛋白測試試劑盒,南京建成,中國;TGF-β1 ELISA試劑盒,Cusabio,中國;smad2抗體、smad3抗體、smad7抗體、METTL3抗體,Proteintech,中國;GAPDH,Bioswamp Goat anti-Rabbit IgG,Bioswamp,中國;TIANScript RT Kit,SuperReal PreMix Plus(SYBR Green),天根,中國;BCA蛋白濃度測定試劑盒,Solarbio,中國。

1.3方 法

1.3.1動物模型建立:大鼠適應性飼養一周,隨機分為兩組,模型組與對照組。對照組喂食正常飼料,模型組給與高脂飼料喂養4周,在第二周摘除左側腎臟,注射青霉素防止感染。術后3周給與 30mg/kg STZ 腹腔注射,連續3d,誘導DKD。若FBG ≥ 16.7moL/L,則判斷糖尿病模型制備成功;然后,繼續高脂飼料喂養,4周后測定尿白蛋白,尿白蛋白≥30mg/24h 即判斷DKD模型制備成功。

1.3.2動物分組及處理:將模型組大鼠按照隨機數字法分為3組(每組8只):DKD組、DKD+siMETTLE3組和DKD+siMETTL3 NC組。siMETTL3 NC 組和siMETTL3組,尾靜脈分別注射METTL3干擾對照慢病毒和METTL3干擾慢病毒,注射20μL,病毒滴度為 1×108TU/mL,每周注射1次,連續4周。對照組和模型組注射等量生理鹽水。

1.3.3標本采集:在取材前收集尿液。心臟采血,靜置30min后,以3000r/ min離心10min,分離血清后于-20℃保存。所有大鼠麻醉處死后,獲得腎臟組織,0.9%氯化鈉溶液中清洗后,一部分腎組織通過4%多聚甲醛固定,另一部分腎組織于-80℃保存。

1.3.4生化指標檢測:采用生化檢測方法測空腹血糖 (FBG)、尿素氮 (BUN)、24h尿蛋白(UTP)的水平。

1.3.5實時熒光定量PCR檢測不同分組細胞中miR126相對表達量:設計miR-126的熒光定量PCR引物。miR-126 loop primer:GTCGTATCC-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCGTACC,Forward primer:TGCGCCATTATTACTTTTGGT,Reverse primer:CCAGTGCAGGGTCC GAGG TATT;U6 Forward primer:CGCTTCGGCAGCACATATAC,Reverse primer:AAATATGGAACGC TTCACGA。加入4 × gDNA wiper Mix 4μL、RNA 2μg,RNAase-free Water加入至15μL,在42℃環境下進行2min的反應,繼續加入5 × HiScript Ⅱ Select qRT SuperMix Ⅱ 4μL、Oligo (dT)23VN /mirna loop primer (10μM) 1μL,在溫度為50℃環境下,進行15min的分離,再在85℃環境下進行5s的分離,隨后將獲取得到的逆轉錄產物cDNA置于冰上或冷藏備用。qPCR的反應試劑及步驟:Forward primer 10μM和Reverse primer 10μM各加入0.4μL,2XSYBR Select Master Mix (2×) 加入10μL,RNase-free water 加入4.8μL,cDNA template 加入4μL,50×ROX Reference Dye 2 加入0.4μL,配制成20μL 體系混合均勻。實時熒光定量PCR儀上設計反應參數,參數如下:95℃,10min,95℃,15s,60℃ 60s,95℃,15s,40個循環。使用2-ΔΔCt方法統計分析qPCR結果。

1.3.6Western blot檢測METTL3、smad2、smad3、smad7的蛋白表達情況:將不同分組組織裂解、離心、BCA定量后,檢測METTL3、smad2、smad3、smad7的蛋白表達。方法:配置5%濃縮膠和12%分離膠、樣本變性加樣、電泳和轉膜,將膜裝入 5% TBST封閉液,制置室溫搖床2h,加5mL一抗稀釋液,4℃過夜。10mL二抗 ( 1∶1000稀釋 ) 置于搖床上2h。顯色于暗室中壓片曝光顯影。結果用BandScan分析膠片灰度值,分別計算檢測蛋白條帶與參比蛋白條帶強度比值( % )。

1.3.7ELISA檢測血清中TGF-β1表達:實驗開始前,組織勻漿,取上清。分別設標準孔和樣品孔,每孔加入相應標準品50μL;待測樣本孔中先加入樣本稀釋液40μL,再加入待測樣本10μL。37℃溫育30min。每孔中加入檢測抗體50μL,充分混勻,37℃溫育30min。每孔加顯色劑A 50μL,顯色劑B 50μL,振蕩混勻后,37℃避光顯色10min,每孔加終止液50μL。用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。

2 結 果

2.1各組大鼠體重、血糖、尿蛋白、尿素氮的變化:大鼠血糖結果顯示,DKD組的大鼠血糖水平、尿素氮、24h尿蛋白含量高于Control組,差異有統計學意義(P<0.05);DKD+siMETTL3的血糖水平、尿素氮、24h尿蛋白含量低于DKD組,差異有統計學意義(P<0.05)。大鼠體質量結果顯示,DKD組的體質量低于Control組,差異有統計學意義(P<0.05);DKD+ siMETTL3組的大鼠體質量高于DKD組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠體重、血糖、尿蛋白、BUN的變化

2.2各組大鼠miR-126表達水平的比較:實時熒光定量PCR結果顯示,DKD組的miR-126的表達水平低于Control組,差異有統計學意義(P<0.05);DKD+siMETTL3組的miR-126的表達水平高于DKD組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。

圖2 各組大鼠miR-126表達水平的比較

2.3各組大鼠TGF-β、METTLE3、smad2、smad3、smad7表達水平的比較:采用ELISA檢測不同分組中TGF-β,Western blot檢測不同分組中METTLE3、smad2、smad3、smad7的蛋白表達。實驗結果顯示DKD組的TGF-β、METTLE3、smad2、smad3的表達水平高于Control組,smad7的表達水平低于Control組,差異有統計學意義(P<0.05);DKD+siMETTL3組的TGF-β、METTLE3、smad2、smad3的表達水平低于DKD組,smad7的表達水平高于DKD組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3A-F。

圖3 各組大鼠TGF-β、METTLE3、smad2、smad3、smad7表達水平的比較

3 討 論

m6A修飾是由m6A WER(“writer”,“Erasers”和“Readers”)蛋白介導的動態可逆修飾過程,可以影響幾乎所有類型腎細胞的生物學功能,參與DKD的發生發展[7]。METTL3是一類writer蛋白,在糖尿病腎病患者腎活檢足細胞中升高,并與腎損傷相關[8]。敲除METTL3可顯著降低高糖誘導的足細胞炎癥和凋亡。本研究發現,DKD大鼠腎臟組織中METTL3的表達水平顯著升高,通過siRNA干擾后,METTL3的表達水平降低。同時研究發現,DKD組的血糖、尿素氮、24h尿蛋白含量顯著升高,體質量降低。這與袁瑾的研究結果一致[9]。通過siRNA干擾后,可以顯著降低血糖、尿素氮、24h尿蛋白,提高大鼠體質量。表明糖尿病腎病可促進腎臟組織中METTL3的表達,METTL3也可以對糖尿病腎病發揮調控功能。

進一步研究發現,miRNA可被METTL3介導的m6A修飾調控,影響miRNA的穩態[10]。已知,METTL3的異常表達可以調控miRNA的成熟進程,進而調控miRNA的表達水平,影響疾病的發生發展[11]。前期研究發現在高糖細胞模型中METTL3可以調控miR-126的表達水平,但在DKD動物水平兩者之間的調控關系尚不清楚[6]。本研究發現,在DKD大鼠腎臟組織中miR-126的表達水平顯著降低,干擾METTL3后,miR-126的表達水平顯著升高。表明了METTL3可以在DKD大鼠模型中調控miR-126的表達影響疾病的進展。

腎臟纖維化是DKD發生發展的主要病理特征及核心事件[12]。轉化生長因子-β1 (TGF-β1)是DKD纖維化的關鍵調控因子,TGF-β1的過表達可以激活下游效應Smad通路,刺激腎小球和腎小管細胞上皮間充質轉化、細胞外基質(ECM)的沉積,促進腎臟纖維化,影響腎功能。本研究發現,DKD誘導TGF-β1、smad2、smad3,抑制smad7的表達。通過siRNA干擾后,發生回復。Smad2和smad3是促纖維化因子,而smad7是抗纖維化因子。故本次研究結果表明,抑制METTL3可以有效的抑制DKD腎臟組織的纖維化。

綜上所述,在DKD中METTL3高表達,干擾METTL3可以促進miR-126的表達活性,抑制TGF-β/smad通路,改善病理特征,緩解DKD的進展,這為DKD的機制研究提供了新的方向。